烟曲霉的蛋白质翻译后修饰研究进展

陈显振 方文捷朱信霖廖万清潘炜华

(1.海军军医大学上海长征医院皮肤科，上海 200003; 2.上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海 200003)

【关键字】 烟曲霉；翻译后修饰；磷酸化；乙酰化；糖基化；甲基化

前 言

烟曲霉是一种常见的机会性致病真菌，其孢子漂浮在空气中，人体每天吸入上百个孢子，免疫功能正常人群可通过自身免疫清除吸入的孢子，而在免疫抑制患者中常引起曲霉病[1-2]，曲霉病分为非侵袭性和侵袭性两大类，其中侵袭性肺曲霉病为严重的感染类型，死亡率可高达50%～100%[3]。唑类药物为侵袭性肺曲霉病的临床一线用药，但近年来全球陆续报道烟曲霉对唑类抗真菌药物的耐药率逐年递增。荷兰一项基于1994—2016年的烟曲霉唑类耐药趋势研究共收集4 268株菌株，结果显示唑类耐药率高达4.2%(179/4268)，且近5年明显呈递增趋势[4]。邓淑文等[5]一项基于159株烟曲霉的研究表明，烟曲霉唑类耐药现象在我国也日趋明显。发病率的升高，治疗药物的局限性，促使我们对烟曲霉的发病机制进行更多的研究。目前关于烟曲霉的研究主要集中在基因与蛋白质水平，但是很多生理过程从蛋白质或基因丰度水平不足以解释，因为许多蛋白的活性是在翻译后水平上调节的。翻译后修饰即通过在一个或多个蛋白质氨基酸残基上添加修饰基团，从而改变该蛋白的生理功能。研究发现，烟曲霉翻译后修饰不仅可以影响蛋白结构，还可以调控蛋白的活性、稳定性、定位及蛋白质间互作关系[6]，进而调控着烟曲霉的菌丝及孢子生长、毒力、应激反应及其对抗真菌药物敏感性等生理过程[7-8]。本文回顾了近些年关于烟曲霉翻译后修饰的相关文章，从该角度阐述烟曲霉的致病机制并期待挖掘新的药物靶点，研究主要集中在磷酸化、乙酰化及糖基化等(见表1)。

表1 翻译后修饰调控的生理过程

1 磷酸化修饰

磷酸化修饰调控着烟曲霉众多的生命活动，该过程由蛋白激酶与蛋白磷酸酶相互协调来完成，主要通过在肽链中的Ser、Tyr和Thr残基的侧链羟基添加磷酸基团，来改变蛋白的活性[11]，进而调控着烟曲霉细胞形态、药物敏感性、毒力及应激等过程。

很多信号通路的蛋白分子通过磷酸化进行信号的传递。蛋白激酶A(PKA)可以激活下游分子磷酸化，其介导的信号通路在烟曲霉菌丝生长及毒性中发挥着重要作用。PKA由催化亚基PkaC和调节亚基PkaR组成，任何亚基突变，均会抑制烟曲霉生长与孢子的形成，并且导致毒力降低[32-34]。除了cAMP可以激活PKA外，催化亚基(PkaC)残基的磷酸化也会导致PKA的激活。通过质谱分析发现，在烟曲霉PKA催化亚基上有4个特殊的磷酸化位点，且证实了这些位点的磷酸化在调控生长、分生孢子、胁迫耐受性和毒性方面起关键作用[7]。丝裂原激活蛋白SakA、MpkC是烟曲霉的两个压力应激蛋白激酶，当SakA、MpkC的上游激酶突变时，SakA、MpkC均失去磷酸化，使烟曲霉对高渗压力、ROS(活性氧)、卡泊芬净等应激压力的敏感性均上升，毒力减弱[35-36]，提示磷酸化在应

激过程中发挥重要调控作用。Castro等[37]通过突变SchA激酶，抑制下游蛋白的磷酸化后，发现烟曲霉表现出对雷帕霉素、高钙浓度及高渗胁迫的敏感性增加。与野生株感染小鼠相比，在SchA突变株感染小鼠模型中，孢子及菌丝均发育不良、毒力下降，由此可见磷酸化在烟曲霉形态及毒力中同样发挥重要作用[37]。另有研究发现，应激激活蛋白激酶(SAPK)通过磷酸化修饰也参与烟曲霉应激反应及毒力的调控[38]。磷酸化还可以通过调控信号通路中的相应转录因子来介导各种生理过程[8-9]。

除了信号通路过程中存在磷酸化外，烟曲霉的动力蛋白同样通过磷酸化修饰来调控生理过程。肌球蛋白和肌动蛋白均为烟曲霉动力蛋白，对烟曲霉分泌过程、极性及细胞分裂发挥重要的作用。Class V Myosin(MyoE)是烟曲霉肌球蛋白的一种，MyoE的磷酸化与去磷酸化过程在烟曲霉的生长与形态学发挥重要作用，调控着菌丝生长及菌丝分隔[10]。Cofilin蛋白也是存在于烟曲霉的肌动蛋白结合蛋白，具有解聚合的作用，参与胞内多种重要生命活动，如细胞迁移、黏附、分裂及凋亡等。研究发现Cofilin蛋白的磷酸化可以激活Cofilin蛋白解聚合活性[39]。

部分酶也存在磷酸化位点，例如，Kin1蛋白激酶是真核生物PAR-1/MARK/MELK家族中的一员，在烟曲霉菌丝分隔及毒力中发挥着不可或缺的作用。Juvvadi等[40]通过液相质谱技术鉴定出Kin1是一种磷酸化蛋白，钙调磷酸酶可以使Kin1蛋白去磷酸化，进而调节Kin1蛋白在不同应激中发挥作用。AfPrdx6是烟曲霉过氧化物酶，通过Western Blotting鉴定出该酶存在磷酸化修饰位点，在Erk2激酶的作用，烟曲霉的AfPrdx6的活性大幅增加[41]。烟曲霉中蛋白质磷酸化修饰还可以参与蛋白质降解过程。Fbx15是烟曲霉蛋白质降解过程中重要的蛋白，它连接目标蛋白与泛素基团，从而标记蛋白促进降解。研究发现，无应激条件下，Fbx15呈磷酸化状态位于细胞质中，而在氧化应激条件下，Fbx15迅速发生去磷酸化，与其连接的E3酶亚基SkpA转移至细胞核[42]。

2 乙酰化修饰

乙酰化修饰是指在酶/非酶的作用下将乙酰CoA(乙酰辅酶A)的乙酰基团转移至蛋白质氨基酸残基上。乙酰化修饰主要分为两类：发生在蛋白N端的乙酰化修饰，以及发生在蛋白赖氨酸上的乙酰化修饰，其中赖氨酸的乙酰化修饰是我们目前研究的重点。研究发现烟曲霉中赖氨酸乙酰化修饰广泛存在，由组蛋白乙酰基转移酶(HATs)与组蛋白去乙酰化酶(HDACs)共同调控，是一种可逆性翻译后修饰，其参与调控烟曲霉生长、应激反应及毒力等重要生理功能[17]。借助于质谱的蛋白质修饰组学分析手段，发现HATs和HDACs不仅调控着组蛋白的乙酰化及去乙酰化过程，也调控着其他非组蛋白，如转录因子、细胞骨架蛋白和分子伴侣蛋白(Hsp90)等。

组蛋白乙酰化修饰影响核小体DNA片段长度，通过组蛋白去乙酰化抑制剂(TSA)处理烟曲霉，发现TSA-处理组的核小体DNA长度大于未处理的片段[12]。AfRtt109是烟曲霉中组蛋白乙酰基转移酶，该酶使组蛋白H3亚基K9位、K27与K56发生乙酰化，当敲除Afrtt109时，发现烟曲霉的生长与产孢减少，在大蜡螟中其感染毒力下降，对于DNA损伤因素敏感性增强[43]。另有研究发现GcnE也为烟曲霉中的组蛋白乙酰基转移酶，当gcnE突变时，孢子形成相关基因flbB与brlA表达下调，产孢量降低[44]。HdaA为烟曲霉组蛋白去乙酰化酶，当敲除hdaA基因后，烟曲霉的生长出现缺陷，但是其毒力并没有降低，研究还发现该酶在孢子及次生代谢物产生中发挥着重要的作用[45]。

半乳糖氨基半乳糖(GAG)，由半乳糖和N-乙酰半乳糖胺残基经过α-1-4键线性连接而成的骨架蛋白，是烟曲霉生物膜合成中不可或缺的因子，也是重要的毒力因子[46]。Agd3是GAG的去乙酰化酶，研究发现，当敲除agd3时，GAG将不能发生去乙酰化，菌株生物膜形成过程受损，烟曲霉毒力下降[15]，GAG的去乙酰化在机体免疫反应中同样发挥重要作用[47]。此外，一些伴侣蛋白也存在乙酰化位点，Hsp90是一种重要的分子伴侣蛋白，可以活化多种蛋白，在烟曲霉形态改变、毒力及应激反应中发挥着重要作用[16]。通过液相质谱检测出Hsp90蛋白存在2个乙酰化修饰位点(K27A、K271A)，突变乙酰化修饰位点时，烟曲霉的毒力下降，并且对伏立康唑及卡泊芬净的药物敏感性增强[16,48]。

3 糖基化修饰

蛋白质糖基化是一种常见的翻译后修饰，碳水化合物与蛋白质结合形成糖蛋白，糖基化修饰通过改变蛋白质的结构、活性、稳定性来调控烟曲霉生理过程[26,49]。蛋白质糖基化修饰在烟曲霉的细胞壁合成、生长及毒力等方面发挥着重要作用[50]。

真菌细胞壁作为抵御外界环境重要屏障，含有大量多糖及发生糖基化修饰的蛋白，因此干扰细胞壁表面蛋白的翻译后修饰将影响烟曲霉细胞壁的合成及毒力[6]。很多糖基转移酶在细胞壁蛋白糖基化过程中发挥重要的作用，如Gel1、Gel2，Ecm33p均是烟曲霉中的β-1,3-葡聚糖转移酶，可转移N-聚糖至底物蛋白，使底物蛋白发生糖基化，研究发现敲除gel1不会导致表型改变，而敲除gel2或ecm33p时，烟曲霉表现出生长减慢、异常孢子形成、毒力减弱和细胞壁成分改变，进一步构建Gel1、Gel2、Ecm33p去N-糖基化菌株，结果显示N-糖基化缺失株比N-糖基化正常菌株的细胞壁成分减少，进而影响Gel1、Gel2的膜定位及降解[18-21]。Afstt3为烟曲霉细胞壁蛋白相关的低聚糖转移酶，它可以将N-聚糖转移到新生多肽。通过抑制Afstt3，减少低聚糖糖基化修饰，发现细胞壁糖蛋白减少，进而导致了烟曲霉生长抑制和细胞壁完整性(CWI)受损[22]。

另一种发生于细胞壁蛋白的糖基化修饰为甘露糖基化修饰，由甘露糖基转移酶(PMTs)介导，当敲除不同的PMT基因时，烟曲霉的菌丝形态、对棘白菌素类药物的敏感性及细胞壁成分均会出现不同的改变[23-24]。新发现的半乳糖呋喃糖基转移酶GfsA的功能是转移半乳呋喃糖至半乳甘露聚糖蛋白或其他糖蛋白。敲除gfsA基因后，烟曲霉形态异常，菌丝及孢子的形成受抑制，对米卡芬净及伏立康唑的药物敏感性增强[51-52]，提示半乳糖呋喃糖基化，在烟曲霉形态、药物敏感性上均发挥着作用。GfsC同样为新发现的半乳糖呋喃糖基转移酶，和GfsA具有相同的功能，在烟曲霉形态、细胞表面的疏水性、药物敏感性及毒力发挥不可或缺的作用[53]。

此外，某些蛋白酶上也存在糖基化修饰。研究发现，烟曲霉木聚糖酶(Af-XYNA)具有三个N -糖基化位点(N87、N124和N335)。木聚糖酶经过N-糖基化修饰后，呈现出良好的热稳定性(可以在60℃保持活性)。通过去糖基化酶及N124位点突变，发现去糖基化的木聚糖酶活性降低、pH的适应范围变小[25]。

4 其 他

烟曲霉中还存在其他许多不同种类的蛋白质翻译后修饰，对烟曲霉的生长、次生代谢物、形态及药物敏感性等过程进行调控，如甲基化、棕榈酰化、异戊烯化、法尼基化等修饰。

蛋白质甲基化修饰在烟曲霉生长过程中发挥重要的作用。唑类药物通过抑制14-a-去甲基酶(Erg11)，从而导致14-a-甲基化甾醇累积，细胞膜的通透性改变，烟曲霉死亡[27]，可见去甲基化在麦角甾醇合成过程中发挥着重要作用。CclA为烟曲霉H3L4复合体(组蛋白3赖氨酸4)的甲基化酶，敲除cclA时，H3L4失去甲基化，烟曲霉生长受到抑制，但次生代谢物胶霉毒素增多[28]。

Ras是膜连接的GTP酶，可以激活信号传导通路。烟曲霉中鉴定出两种Ras酶，分别为RasA、RasB，这两种Ras蛋白调控着真菌生长、形态及致病性[30]。Ras蛋白C-端棕榈酰化修饰可以稳定其与细胞膜结合，促进Ras蛋白在质膜上的积累[54-55]。Ras蛋白经过异戊烯化修饰后，疏水性增加，对膜表现出更高的亲和力，并定位于内质网(ER)。敲除法尼基转移酶基因ramA，Ras蛋白的法尼基化修饰降低，RasA蛋白膜定位量减少，烟曲霉的生长、毒力受到抑制，对唑类药物的耐药性增强[56]。

此外，在烟曲霉中，还发现存在泛素化、SUMO化等不同的翻译后修饰[6]，这些修饰可能在烟曲霉形态、毒力及药物敏感等过程中均发挥着不同的调控作用。

5 展 望

翻译后修饰参与多种生理过程，调控着烟曲霉的形态、毒力及药物敏感性等。烟曲霉耐药率逐年升高，促使我们去发现新的药物靶点来改变这一现象。翻译后修饰参与烟曲霉多个生理过程，可作为未来新型抗真菌药物的潜在研究靶点。其次，关于烟曲霉翻译后修饰的研究局限于单个蛋白的单一修饰，很多蛋白存在多种修饰，且烟曲霉各种生理过程间存在相关性，不同的修饰间必然也存在相关作用关系。为了揭示烟曲霉复杂生理过程，应联合多种翻译后修饰来了解其作用机制。