以大蜡螟幼虫为模型研究伏立康唑抗茄病镰刀菌效果

李梦寒 赵望 贾庚佩 孙毅 曾同祥

(1.长江大学，荆州 434100； 2.长江大学附属荆州医院全科医学科，荆州 434100; 3.长江大学附属荆州医院皮肤病与性病科，荆州 434100)

镰刀菌广泛存在于土壤中和植物上，是一种条件致病菌，临床上可引起角膜炎、皮肤感染及深部感染，其中镰刀菌性角膜炎相对常见，而本病最常见的致病菌种是茄病镰刀菌[1-3]。目前临床上随着广谱抗菌药物、糖皮质激素及免疫抑制剂的广泛应用，皮肤及深部镰刀菌感染的报道不断增加[4]。但伏立康唑治疗侵袭性镰刀菌病的成功率仅为 46%～67%，而两性霉素B通常因其不良反应导致治疗失败[5-7]。

大蜡螟幼虫作为一种昆虫模型，可以作为病原真菌感染模型，如曲霉、念珠菌等，且研究结果与哺乳动物模型有正相关性[8-10]。既往的研究表明，大蜡螟幼虫具有完善的先天免疫应答机制，并在上皮细胞防御、细胞免疫及体液免疫应答上与哺乳动物共享进化模式并保持一致[11-13]。大蜡螟幼虫可以在25～37℃环境中生存，因此该模型适合于人体镰刀菌感染的相关研究[14-15]。大蜡螟幼虫模型与传统的哺乳动物感染模型相比，易存活，价格便宜，操作方便，实验周期短，已被广泛用作评价微生物病原体(包括真菌病原体)毒力和抗菌药物疗效的替代模型[16-19]。但在中国知网和PubMed上检索既往中英文文献，未查找到关于茄病镰刀菌的大蜡螟幼虫感染模型的研究。

本研究的目的是建立大蜡螟幼虫体内模型以研究茄病镰刀菌的毒力，同时检测伏立康唑对茄病镰刀菌的体内抗菌效果，为构建茄病镰刀菌毒力及抗真菌治疗的动物模型提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验菌株 茄病镰刀菌BMU7905(由北京大学第一医院惠赠)，在沙堡弱固体培养基平皿上35℃培养3 d后收集新鲜孢子。用生理盐水将活化好的茄病镰刀菌制成浓度为1×108CFU/mL的孢子悬液。

实验用药 伏立康唑(批号S1442，纯度>99%)购自美国Selleck公司。使用分析纯度二甲亚砜来溶解并配置为6 400 μg/mL母液，用生理盐水稀释为100 μg/mL工作液。

实验动物 大蜡螟幼虫购自四川省成都宠物饲料公司，幼虫为六龄幼虫，长度2～3 cm，体重平均0.33 g/只。实验均挑选活力好，无黑斑幼虫。大蜡螟幼虫注射方法：选择25 μL尖头微量进样器(上海高鸽工贸有限公司)作为注射工具，吸取菌悬液或抗菌药物工作液，经大蜡螟幼虫左下腹后足注射入大蜡螟幼虫体内。大蜡螟幼虫孵育环境：将大蜡螟幼虫分组后，每一组大蜡螟幼虫分别置于一次性塑料培养盒内，并向其中加入适量的纱布和少量的水来保持环境的湿度，之后将培养盒放入37℃恒温培养箱中孵育。

1.2 菌株毒力检测实验

菌液稀释 用生理盐水将制备好的高浓度的菌悬液分别稀释至1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL。

分组、注射及孵育 本实验分为6组，每组20只大蜡螟幼虫(其中C1、C2组为对照组，T1、T2、T3、T4组为实验组)。C1组不做任何处理作为空白对照；C2组每只幼虫注射无菌生理盐水10 μL作为阴性对照；T1组每只幼虫注射浓度为1×105CFU/mL的菌悬液10 μL(103/幼虫)；T2组每只幼虫注射浓度为1×106CFU/mL的菌悬液10 μL(104/幼虫)；T3组每只幼虫注射浓度为1×107CFU/mL的菌悬液10 μL(105/幼虫)；T4组每只幼虫注射浓度为1×108CFU/mL的菌悬液10 μL(106/幼虫)。注射完成后，将所有大蜡螟幼虫放回培养盒内，置于37℃培养箱中孵育达5 d，并每24 h记录大蜡螟幼虫死亡数量(幼虫死亡后表现为：虫体不移动、触之无反应、体表颜色变黑)(见图 1)。此实验重复2次，比较2次实验结果，结论一致。

结果分析与绘图 在Graphpad 8.0软件上，将连续5 d大蜡螟幼虫的生存数据录入系统，并绘制大蜡螟幼虫的生存曲线图。由于本实验的目的之一为测定茄病镰刀菌菌株的毒力以确定最适接种量，因此根据绘制的大蜡螟幼虫生存曲线(见图2)，分析结果，最终确定茄病镰刀菌能够在120 h时使幼虫死亡率达到100%的菌液浓度(1×107CFU/mL)为最适接种浓度，为后续的抗菌药物疗效测定提供实验依据。

1.3 体内抗真菌药物敏感性实验

菌液配置 用生理盐水稀释孢子悬液，调到合适的感染浓度(1×107CFU/mL)。

分组、感染、抗菌药物治疗及孵育 本实验分为4组，每组20只大蜡螟幼虫(其中C3、C4组为对照组，T5、T6组为实验组)，分组后分别将大蜡螟幼虫按组别放入培养盒内，并做好相应标记。C3组不做任何处理作为空白对照；C4组每只幼虫注射无菌生理盐水10 μL作为阴性对照；T5、T6组每只幼虫注射浓度为1×107CFU/mL的菌悬液10 μL(105/幼虫)。将4组大蜡螟幼虫放回相应培养盒，置于37℃培养箱孵育2 h后取出，C3组不做任何处理；C4、T5组每只幼虫注射5 μL生理盐水；T6组每只幼虫注射5 μL伏立康唑(0.5 μg/幼虫)。给药完成后，将所有大蜡螟幼虫放回培养盒内，置于37℃培养箱中孵育达5 d，并每24 h记录大蜡螟幼虫死亡数量(幼虫死亡后表现为：虫体不移动、触之无反应、体表颜色变黑)(见图 1)。此实验重复2次，比较2次实验结果，结论一致。

结果分析与绘图 在Graphpad 8.0 软件上，将连续5 d大蜡螟幼虫的生存数据(见表1)录入系统，并绘制大蜡螟幼虫的生存曲线图。

表1 由茄病镰刀菌BMU7905感染的大蜡螟幼虫经伏立康唑治疗组及其他对照组连续5 d的生存数据Tab.1 Survival data of the G. mellonella larvae infected by F. solani BMU7905 in the voriconazole treatment group and other control groups for 5 consecutive days (n)

1.4 病理组织切片的制备

为了评估宿主组织内的真菌感染情况，将收集的第2天死亡的T5、T6组大蜡螟幼虫尸体用于制备组织病理切片。纵向切开虫体，并将虫体浸泡于4%多聚甲醛中，然后将固定的大蜡螟幼虫包埋在石蜡中，切片后，用苏木精和伊红(H&E)染色剂染色。

2 结 果

2.1 茄病镰刀菌菌株毒力检测结果

在菌株毒力检测实验中(见图 2)，当菌液浓度为1×107CFU/mL时，大蜡螟幼虫累计5 d的死亡率达100%，当菌液浓度为1×106和1×105CFU/mL时，大蜡螟幼虫累计5 d的死亡率未超过30%，当菌液浓度为1×108CFU/mL时，大蜡螟幼虫在第1 d的死亡率达100%，而未处理组和生理盐水对照组的大蜡螟幼虫累计5 d的死亡率未超过5%，因此我们选择1×107CFU/mL作为接种浓度并成功建立茄病镰刀菌BMU7905-大蜡螟幼虫感染模型。

2.2 大蜡螟幼虫感染后的抗菌药物疗效

由茄病镰刀菌BMU7905感染后的大蜡螟幼虫在经过伏立康唑治疗后，其120 h生存率明显高于单菌组，且生理盐水对照组和未处理组生存率超过90%(见图3)，因此，我们认为伏立康唑具有较好的虫体内抗茄病镰刀菌作用。

图3 由茄病镰刀菌BMU7905感染的大蜡螟幼虫经伏立康唑治疗组及其他对照组生存率曲线. C3. 未处理；C4. 生理盐水；T5. 茄病镰刀菌BMU7905；T6. 茄病镰刀菌BMU7905+伏立康唑(0.5 μg/幼虫)Fig.3 Survival rate of the G. mellonella larvae infected by F. solani BMU7905 in the voriconazole treatment group and other control groups. C3. untreated; C4. normal saline; T5. F. solani BMU7905; T6. F. solani BMU7905+ voriconazole (0.5 μg /larva)

2.3 大蜡螟幼虫被茄病镰刀菌BMU7905感染后体腔组织的病理改变

病理切片染色结果发现大量镰刀菌菌丝和孢子(见图4)。

图4 大蜡螟幼虫被茄病镰刀菌BMU7905感染后体腔组织的病理改变(H&E染色). T5. 茄病镰刀菌BMU7905感染(A：×10；B：×40)； T6. 茄病镰刀菌BMU7905+伏立康唑(0.5 μg/幼虫)(C：×10；D：×40)；黑色箭头：菌丝团及孢子Fig.4 Pathological changes of body cavity tissues after the G. mellonella larvae were infected by F. solani BMU7905(H & E staining). T5. F. solani BMU7905 infection (A：×10；B：×40); T6. F. solani BMU7905 + voriconazole (0.5 μg/larva) (C：×10；D：×40); black arrow: hyphae clumps and spores

2.4 统计学分析

在Graphpad 8.0软件上，对图2、图3中生存曲线所有组别进行Log-rank test和Gehan-Breslow-Wilcoxon test统计学分析，结果均为P<0.0001, 图2、图3中生存曲线差异有统计学意义。

3 讨 论

在本研究中，成功地建立了茄病镰刀菌感染的大蜡螟幼虫模型以研究抗菌药物在动物体内的疗效。菌株毒力检测实验表明，大蜡螟幼虫的生存率随着菌液浓度的增加而降低。当大蜡螟幼虫被第5 d达100%致死量的浓度的茄病镰刀菌感染时，用伏立康唑治疗显著提高了大蜡螟幼虫的生存率。此结果与已有的体外研究及临床病例研究的结果具有一致性[20-23]。被茄病镰刀菌感染的大蜡螟幼虫尸体的病理切片发现了大量镰刀菌菌丝和孢子也佐证了动物模型的有效构建。参与大蜡螟幼虫免疫反应的血细胞与哺乳动物的中性粒细胞在结构和功能上高度相似，体液免疫包括黑化作用、调理素和抗菌肽的产生。生物基因组研究表明，大蜡螟有许多与人类基因同源的编码产物参与病原体识别与信号转导。因此在研究免疫系统对于病原体的反应及反应机制时，大蜡螟幼虫具有相当大的优势。大蜡螟对茄病镰刀菌感染的免疫情况还需进一步研究。在真菌病模型中，大蜡螟现已广泛应用于白念珠菌、光滑念珠菌、曲霉、组织胞浆菌、孢子丝菌、新生隐球菌、毛霉及镰刀菌等致病真菌的致病机制、宿主免疫、毒力评估及抗真菌药物药效学评价等领域，大蜡螟幼虫可进行大样本的研究便于统计分析，而且动物伦理方面的限制较少[24-28]。当需要初步验证体外实验结果，又碍于哺乳动物实验的种种困难，大蜡螟幼虫是一个很好的选择。当然，本实验只研究了茄病镰刀菌BMU7905这一种型号的镰刀菌，在菌株是否具有代表性上存在劣势。目前，临床上治疗茄病镰刀菌病的常规方案是两性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑等抗真菌药物单独或联合治疗以及纠正中性粒细胞减少来增强免疫功能，有些病例还可手术清除感染灶。其中，抗真菌药物疗效仍未确定，具体治疗药物及其剂量还需通过药物敏感性实验结果做出选择。尽管以上实验在一定程度上证实了伏立康唑有较好的抗茄病镰刀菌效果，但在用法用量方面还需进一步研究，才能更好地指导临床治疗。另外，对于伏立康唑与其他药物联合治疗镰刀菌病还有待深入研究。本实验丰富了大蜡螟幼虫作为真菌感染模型方面的研究，为后续针对镰刀菌病的治疗提供了研究思路和实验依据。

4 结 论

大蜡螟幼虫感染模型可以作为哺乳动物模型的替代方案，用于研究茄病镰刀菌的毒力以及检测抗真菌药物对茄病镰刀菌的体内抗菌效果。但虫体结构与人体仍存在较大差异，所以还不能完全替代更精细的哺乳动物实验。

致谢：感谢北京大学第一医院李若瑜教授惠赠茄病镰刀菌菌株！