miRNA-320对氧糖剥夺P12细胞的影响及机制

严永兴 张艳 王俊 刘慧丽 吴春丽

脑卒中已成为我国第一位死亡病因，其中缺血性脑卒中约占脑卒中总数的70%～80%，严重影响患者生活质量，给家庭、社会带来沉重负担［1-2］。而缺血再灌注损伤是导致缺血性卒中重要的病理生理机制，其包括氧自由基生成、钙超载、细胞凋亡、炎症反应等［3-4］。miRNA是一段长约21～28个核苷酸的单链小RNA，由非编码区转录而成，主要存在于细胞及血浆中且保持高度稳定。目前已发现数种miRNA与脑缺血再灌注损伤过程有关联，如miRNA-34a可调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NOX2）蛋白表达［5］，miRNA-29b可参与抗凋亡蛋白（Bcl2）的生成等［6］。既往研究发现miRNA-320可引起心肌细胞凋亡和心肌梗死［7］，但其在脑缺血再灌注损伤中的作用仍不清楚，本文探讨miRNA-320对氧糖剥夺P12细胞的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器 P12细胞（褐家鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤）购自南京华奥生物医药技术有限公司。细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天公司，IGF-1抗体购于美国AFFINTY公司，SYBR Green qPCR试剂盒购于Thermo公司，逆转录试剂盒购于Fermentas公司，DMEM基础培养基购于Hyclone公司，Tunel试剂盒购于Roche公司，MTT Cell Viability Assay Kit购于abnova公司，miRNA-320 拟似物和miRNA-320抑制剂试剂购自于上海吉玛制药技术有限公司，恒温振荡培养箱（华美生化仪器有限公司），实时荧光定量PCR仪（美国Stratagene公司），生物倒置显微镜（德国OLYMPUS公司），酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1.2 方法 （1）实验模型制备与分组：P12细胞培养于含5%胎牛血清，5%马血清和10 U/L链霉素的DMEM培养液中，置于37℃ 5% CO2湿润的细胞培养箱中。按照Lipofectamine 2000试剂盒的转染步骤准备转染试剂，一只EP管（A管）用250 μL Opti-MEM稀释5 μL Lipofectamine 2000，室温静置5 min，一只EP管（B管）用250 μL Opti-MEM稀释10 μL mimics/inhibitor（储存浓度为10 μM）；将A、B两管的溶液混匀后，室温静置20 min；将siRNA-lipofectmine 2000混合液加入到含有1.5 mL完全培养基的6孔板中；转染4～6 h后更换培养基备用。无糖DMEM培养基预先置于混合气（95%N2和5% CO2）中平衡；转染培养3天后P12细胞经无糖DMEM刷洗2遍后，补加无糖DMEM后置于氧剥夺室。氧剥夺室预先经混合气体以10 L/min的流速充满，4 min后形成缺氧环境。然后将处理后的P12细胞置于预先缺氧的剥夺室，4 h后将P12细胞恢复到正常水平的葡萄糖和氧环境中。24 h后收集细胞以备检测。实验分正常对照组（正常P12细胞），模型组（氧糖剥夺组，OGD组），miRNA-320拟似物组（OGD+miRNA-320 mimics组），miRNA-320抑制剂组（OGD+miRNA-320 inhibitor组）。（2）MTT检测：使用MTT法测定细胞增殖。取对数生长期的P12细胞接种于96孔板，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL Sigma公司）溶液放置培养箱内避光孵育4 h后，再每孔加入200 μL DMSO溶解贴壁细胞，置于摇床上室温振荡10 min，采用酶标仪测定各孔492 nm的吸光度，进行细胞增殖分析。（3）TUNEL检测：参照说明书进行TUNEL检测。细胞经4%多聚甲醛室温固定30分钟后，将样本浸入3% H2O2封闭液中室温封闭10 min，PBS洗涤3次，5 min/次。加入50 μL TUNEL反应液于标本上，37℃孵育1 h，再次PBS冲洗后加入50 μL POG于标本上，30 min后PBS冲洗加入50 μL DAB显色工作液在室温处理5 min，随后滴加苏木素染色1 min后浸入1%盐酸甲醇溶液中分化5 s，蒸馏水冲洗干净盖玻片封片，显微镜下观察拍照。（4）qRT-PCR检测：收集各组细胞，采用TRIzol试剂提取细胞中总RNA，紫外分光度计测量RNA浓度和纯度。cDNA合成试剂盒进行反转录，反应体系为42℃，30 min；85℃，10 min。荧光定量PCR扩增检测miRNA-320-3p，IGF-1 mRNA的表达水平，反应体系为95℃，3 min，95℃，12 s，62℃，40 s，40次循环，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，根据Genebank分布的各基因相应mRNA序列，使用Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物，引物由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。（5）WB检测：P12细胞经氧糖剥夺后取出，弃培养基后PBS洗涤3次，加入细胞裂解液。裂解完后于4℃下12,000 rpm离心15 min，收集上清液，采用碧云天BCA蛋白溶度测定试剂盒测定蛋白溶度。蛋白样品与loading buffer混合后于100℃处理5 min。经制备SDS-PAGE凝胶后，每孔上样50μg蛋白，电泳分离，聚偏二氟乙烯膜（PVDF）转膜90 min，使用TBST洗涤PVDF膜后5%脱脂奶粉封闭，室温下摇床2 h，再次洗涤后用稀释的一抗封闭（稀释比例：IGF-1∶1∶1,000；β-action：1∶2,000），置于4℃冰箱孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL显影，胶片曝光测定蛋白浓度，每个蛋白条带的灰度比值代表蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-320抑制细胞增殖和促进P12细胞凋亡 与对照组比较，模型组细胞增殖能力明显减弱、细胞凋亡增加（P＜0.01）；与模型组比较，miRNA-320拟似物组细胞增殖下降（P＜0.01）、细胞凋亡增加（P＜0.05）；而miRNA-320抑制剂组细胞增殖显著增加（P＜0.01）、细胞凋亡减弱（P＜0.05）。见图 1～3。

图1 MTT检测细胞增殖情况

图2 TUNEL检测细胞凋亡图

图3 各组细胞凋亡率比较

2.2 miRNA-320、IGF-1基因表达 与对照组比较，模型组miRNA-320表达上调、IGF-1 mRNA表达下降（P＜0.01）；与模型组比较，miRNA-320拟似物组miRNA-320表达上调、IGF-1 mRNA表达下调（P＜0.01）；而miRNA-320抑制剂组miRNA-320表达下调、IGF-1 mRNA表达上调（P＜0.01）。见图4～5。

图4 各组microRNA-320的相对表达量

图5 各组IGF-1mRNA的对表达量

2.3 IGF-1蛋白表达 与对照组比较，模型组IGF-1蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，miRNA-320拟似物组IGF-1蛋白表达降低（P＜0.01）；而miRNA-320抑制剂组IGF-1蛋白表达明显增加（P＜0.01）。见图6～7。

图6 各组IGF-1蛋白表达条带图

图7 各组IGF-1蛋白相对表达量比较

3 讨论

缺血性卒中是一类严重危害人类健康的常见病、多发病，其具有发病率、致残率、病死率高［8］。目前临床上治疗措施主要为早期血管开通及脑保护治疗。尽管近年来缺血性卒中的诊治技术取得新进展，但卒中发生后患者的病理生理过程无法逆转，使患者的神经功能恢复不佳。缺血再灌注损伤是缺血性卒中的重要病理生理机制，因此如何减轻再灌注损伤，挽救缺血半暗带区细胞也是一重要治疗方法［9］，值得临床医师重视。

P12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化株，具有类似神经元的形态的生理生化特征，已广泛应用于神经生理、药理等研究［10］。为此本研究亦采用P12细胞建立细胞氧糖剥夺模型，探讨miRNA-320在体外脑缺血再灌注损伤中的作用。结果成功建立了氧糖剥夺模型，与正常对照组比较，模型组细胞增殖明显下降、细胞凋亡明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

miRNA与各类疾病的发生发展密切相关，其可参与氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、血脑屏障破坏等病理生理过程［11-13］。SONG等［7］研究发现在心肌缺血再灌注损伤模型中，miRNA-320通过IGF-1途径引起心肌细胞凋亡，而抑制miRNA-320表达后可保护心肌细胞坏死。SEPRAMANIAM等［14］研究发现，大鼠动脉栓塞缺血1 h再灌注1 h后，通过抑制miRNA-320a的表达可增加AQP-1和AQP-4基因表达水平，通过AQP-1和AQP-4蛋白途径从而减轻脑损伤，减少脑缺血再灌注脑梗死体积。动物实验研究［15］发现miRNA-320可增加大鼠皮层神经元凋亡，增加梗死体积和脑水肿，本实验应用P12细胞进行氧糖剥夺后正常培养模拟生物体内的缺血再灌注现象，结果发现：miRNA-320可促进细胞凋亡、抑制细胞增殖，而miRNA-320抑制剂可明显改善此种现象，从体外实验进一步证实miRNA-320在脑缺血再灌注损伤中的作用。

既往研究［7］发现miRNA-320可作用于IGF-1发挥作用。IGF-1是由70个氨基酸组成的单键碱性多肽，是一种重要的调节神经生长的生物活性物质，在脑缺血再灌注损伤时可减轻神经元损伤，动物实验也表明脑内注射IGF-1可限制神经元损伤的程度，并阻止神经元进一步死亡。本研究结果显示，miRNA-320拟似物组与模型组比较，miRNA-320表达上调、IGF-1 mRNA及IGF-1蛋白表达下降，而miRNA-320抑制剂组与拟似物组完全相反。提示，缺血再灌注损伤后，miRNA-320表达增高，IGF-1蛋白表达降低，应用miRNA-320抑制剂后提高IGF-1表达后细胞增殖存活率增加，细胞凋亡减少。

综上所述，miRNA-320可能通过调控IGF-1水平对脑缺血再灌注损伤起作用，miRNA-320对神经元的作用及机制有望成为缺血性卒中治疗的新靶点。