Apelin通过UCP2减轻缺血再灌注对大鼠肺血管内皮细胞的损伤
2022-03-02陈超星蔡瑶瑶朱慧杰夏芳芳
陈超星 蔡瑶瑶 朱慧杰 夏芳芳
肺缺血/再灌注损伤(LIRI)系多因素所致肺缺血基础上恢复灌注后,肺损伤加重的现象,主要表现为肺水肿和急性呼吸窘迫综合征。肺上皮是限制各种毒性物质进入呼吸系统维持肺稳态的屏障,因此肺上皮细胞也被认为在防御感染和发病机制中起关键作用[1]。破坏肺泡上皮细胞可能会导致各种肺部疾病的发生发展,如慢性阻塞性肺疾病和急性肺损伤[2-3]。LIRI导致的多种炎性介质产生和释放后使肺微血管通透性增加,诱发肺泡上皮细胞凋亡增加从而导致肺内皮功能障碍[4]。研究表明,Apelin-13干预通过诱导解耦联蛋白2(UCP2)表达下调控制炎症因子表达,减轻氧化应激反应和抑制凋亡反应从而减轻大鼠肺LIRI有关[5]。UCPs是一种线粒体内膜蛋白,广泛分布于肺、脑、脾、肾等多种器官,且参与细胞各项生理功能,尤其在抗氧化应激反应发挥重要作用[6]。研究认为,UCP2参与减少活性氧自由基(ROS)的产生,并抑制ROS介导的肺上皮细胞凋亡[7]。本文探讨Apelin对LIRI治疗作用及机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 原代SD乳鼠(2~3 d)购买于温州医科大学动物实验中心。实验过程及对动物的处置符合温州医科大学动物伦理要求。
1.2 方法 (1)SD乳鼠肺泡上皮细胞分离与培养:原代SD乳鼠肺上皮细胞培养:取出生2~3天的SD乳鼠,紫外光照射30 min,用75%乙醇浸泡消毒5 min,剪刀从剑突左缘剪开胸骨,用镊子夹出肺组织置于PBS洗去血液,用组织剪去除尽可能多的表面胸膜,PBS混悬,待组织块自然沉降后吸弃上清液,重复3~4次至上清液清亮,用剪刀剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块,0.1%胰酶(美国Gibco公司,25200-072)37℃消化15~20 min,大部分组织块被消化为细胞悬液,加适量含10%FBS(美国Gibco公司,10099-141)的DMEM(美国Gibco公司,C11995500BT)终止消化,用吸管充分吹打均匀,1,000 r/min离心10 min。弃去上清液,较均匀地接种在5 mL玻璃培养瓶上,加入上述DMEM培养液约0.5 mL于37℃,95%空气+5% CO2培养箱过夜,次日加入2 mL培养液继续培养。(2)实验分组:培养细胞生长融合至80%左右时,更换无血清的高糖DMEM培养液饥饿细胞24 h,使细胞周期同步化,然后进行分组及药物干预。将细胞培养基换成无糖培养基后,暴露于具有5%CO2和95%N2的缺氧室中,37℃下2 h,然后在95%O2和5%CO2恒温培养箱中复氧2 h(细胞AR模型)。对照组(Con组):肺上皮细胞不进行AR处理。AR组:将肺上皮细胞缺氧/复氧AR处理;Apl组(AR + Apelin):肺上皮细胞复氧前给予Apelin(TOCRIS,217082-60-5)(3)CCK-8法检测细胞增殖活性:将细胞接种到96孔培养板中,四周每孔加入100 μL无菌PBS防止边缘效应。显微镜下观察细胞生长至对数期,更换无血清培养基同步化12 h。按照分组造模后,弃掉培养基,每孔加入预先配置好的CCK-8工作液(日本DOJINDO公司,CK04,DMEM与CCK-8试剂按1∶9比例均匀混合)100 μL,在37℃恒温培养箱中避光孵育1~2 h。酶标仪检测波长为450 nm处的吸光度,记录每个孔的OD值。(3)Westernblot法检测UCP2蛋白表达:将细胞收取在适量的RIPA裂解缓冲液中。使用BCA蛋白测定试剂盒(碧云天生物科技公司,上海)对总蛋白进行定量,用10%SDSPAGE分离,将分离的条带用湿转法转移到PVDF膜上,并用含5% 脱脂奶粉的TBST室温下封闭1 h。孵育UCP2 Antibody(Abcam,ab97931)以探测标记,再通过与山羊抗兔IgG(H+L)HRP孵育后加入ECL发光液将其可视化,从而检测免疫反应带。(4)ELISA法检测IL-1β、IL-6和TNF-α的表达:根据制造商的说明(Bioscience,San Diego,CA),通过ELISA测定培养基的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)含量。将IL-1β、IL-6和TNF-α的量标准化为细胞的蛋白质浓度。
1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料正态性采用Shapiro-Wilk检验。符合正态分布计量资料以()表示,偏态分布计量资料资料用M(Q1,Q3)表示。多组比较采用单因素方差分析,方差齐性者采用LSD法,方差不齐者采用Dunnett's T3检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度Apelin对肺上皮细胞LIRI细胞活力的影响 分别设立5个Apelin的浓度,分为7组:Con组、AR组、AR+Apelin0.5μmol/L组(A0.5组)、AR+Apelin 1μmol/L(A1组)、AR+Apelin 2μmol/L(A2组)、AR+Apelin 5μmol/L(A5组)、AR+Apelin 10 μmol/L(A10组)。与Con组比较,AR组肺上皮细胞的吸光度降低,差异有统计学意义(P<0.05);而与AR组比较,A2组、A5组、A10组中的肺上皮细胞吸光度增加(P<0.05),但A2组的细胞活力最佳。见表1。
表1 不同浓度Apelin对肺上皮细胞LIRI细胞活力的影响()
表1 不同浓度Apelin对肺上皮细胞LIRI细胞活力的影响()
注:与Con组比较,*P<0.05;与AR组比较,#P<0.05
组别 OD 450 Con组 1 AR组 0.44±0.99*A0.5组 0.49±0.93*A1组 0.64±0.10*A2组 0.88±0.05*#A5组 0.90±0.09*#A10组 0.95±0.12*#
2.2 3组乳鼠肺上皮细胞UCP2蛋白表达比较 与Con组比较,AR组肺上皮细胞UCP2蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05),与AR组比较,Apl组肺上皮细胞UCP2蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。
图2 3组小鼠肺上皮细胞UCP2蛋白表达比较
2.3 3组肺上皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达比较 与Con组比较,AR组肺上皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);与AR组比较,Apl组肺上皮细胞IL-1β、IL-6和TNF-α表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。
表2 3组肺上皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达比较()
表2 3组肺上皮细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达比较()
注:与Con组比较,*P<0.05;与AR组比较,#P<0.05
组别 IL-1β(pg/mL) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL)Con 组 82.81±4.56 25.86±2.54 161.77±8.26 AR 组 107.13±5.51* 60.72±3.56* 210.70±9.65*Apl组 85.86±5.70# 35.94±6.21*# 181.29±6.12*#F值 18.87 50.21 27.45 P值 0.003 <0.05 <0.05
3 讨论
本研究结果表明,缺氧复氧损伤会导致肺上皮细胞活力降低、炎症反应增加以及UCP2蛋白表达降低,而Apelin能改善肺上皮细胞缺氧复氧的损伤,减少炎症反应,增加UCP2蛋白的表达。提示,UCP2参与调控Apelin对肺上皮细胞缺氧复氧的保护机制。
LIRI仍是肺移植术后的主要问题之一。LIRI导致微血管通透性增加,肺中多形核中性粒细胞被隔离,以及肺泡内皮功能障碍。此外,肺泡上皮细胞的过度凋亡会损害上皮屏障[8],并伴随着肺泡上皮细胞的衰老和炎症反应[9]。肺功能主要取决于肺泡上皮细胞[10],因此本研究选择了提取原代肺上皮细胞用于研究。
线粒体是产生氧化应激的主要来源,过多难以清除的ROS触发炎性反应,最终导致肺血管内皮的损伤、肺水肿,影响肺功能,在肺缺血再灌注损伤中发挥重要作用[11-12]。UCPs位于线粒体内膜上,属于线粒体阴离子转运蛋白超家族,通过控制质子跨过线粒体内膜的泄漏使ATP合成过程和氧化磷酸化过程脱钩[13]。UCPs是重要天然抗氧化剂,与清除酶(如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)和低分子量抗氧化剂(如抗坏血酸和谷胱甘肽)一起参与维持ROS稳态[14]。LUO等[15]研究认为,UCP2过表达能够保护线粒体超微结构,抑制线粒体分裂,改善线粒体ATP合成。本资料结果显示,缺氧复氧引起肺上皮细胞的活力降低和炎症反应与UCP2蛋白的表达降低一致。
Apelin作为一种内源性配体,具有肺保护作用[16-17]。ZHANG 等[10]研究表明,Apelin-13 能够通过减轻ROS反应改善博来霉素诱导的肺损伤过程中的线粒体功能障碍减轻肺损伤,从而抑制肺纤维化损伤的进展。而在另外一个急性肺损伤模型中,研究者从动物载体和细胞水平两种途径验证Apelin-13能够抑制ROS形成和炎性反应从而改善LPS诱导的急性肺损伤[17]。DUAN等[18]研究结果提示,Apelin能够抑制I/R诱导的ROS介导的氧化应激和炎症反应,从而诱导抗氧化酶的表达。文献报道过Apelin可能降低白色和棕色脂肪组织中UCP1和肌肉组织中UCP3表达水平,从而导致肥胖和不孕[19]。提示Apelin能够作用于UCP受体。本研究证实Apelin和UCP2受体的相互作用,发现Apelin能够通过促进UCP2蛋白的表达降低氧化应激损伤和炎症反应,减轻线粒体损伤,从而改善肺上皮细胞缺氧复氧损伤。
综上所述,缺氧复氧损伤会导致肺上皮细胞活力降低、炎症反应增加和UCP2蛋白表达下降,Apelin-13干预通过上调UCP2蛋白表达控制炎症因子表达,减轻氧化应激反应从而减轻肺上皮细胞缺氧复氧导致的细胞损伤。