‘圣诞快乐’朱顶红花芽分化研究

李 心 杨柳燕 王 桢 孙 翊 许俊旭 张永春

（上海市农业科学院林木果树研究所，上海 201403）

朱顶红（）是石蒜科（Amaryllidaceae）朱顶红属（）多年生球根花卉，其花朵硕大、色彩多样、形态多姿且开花期长，是优异的切花、盆栽、庭院应用花卉，在国内外均具有较大的市场价值。广义的花芽分化包括生理分化、形态分化和性细胞分化成熟三个过程。对植物的花芽分化过程进行深入研究，有利于指导花发育研究、花期精准调控和杂交育种，并为植物的系统发生研究提供理论依据。

目前朱顶红的相关研究主要集中在组培快繁、杂交育种、功能成分、遗传多样性、性状观测、基因表达、抗逆生理、花期调控等方面。朱顶红的花芽生长情况、花器官分化进程相关研究较少且结论并不一致。Doorduin 等对朱顶红品种‘红狮’的研究认为，在15～25 ℃的土温控制下，朱顶红一年产生的花序芽为3～6 枚，且随温度升高其数量呈增加趋势。原雅玲等在对‘苹果’和‘外院1号’朱顶红品种研究过程中，认为朱顶红一年有3 次花序芽分化且只有4 月分化的花序芽可以于次年正常开花，而8 月和12 月分化的花序芽均败育。而吴永朋等对‘红狮’、‘西杂1 号’和‘橙色赛维’3 个朱顶红品种进行解剖观测，认为其一年分化生长2个花序芽并部分有败育现象。关于朱顶红性细胞分化成熟过程的研究目前还未见报道。朱顶红品种扩繁大多采用鳞茎球自然或切割繁殖，然而新品种的培育却大多来源于杂交育种。正确了解雌雄性细胞的分化和成熟过程有利于探究育种过程中的生殖败育，指导杂交组合的有效配置。

本研究以朱顶红品种‘圣诞快乐’为试验材料，采用解剖观测和石蜡切片技术对朱顶红的花芽周年生长情况，花器官分化以及性细胞分化成熟过程进行研究，旨在为朱顶红的花发育研究、花期调控、杂交育种及系统分类等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

朱顶红品种‘圣诞快乐’种植于上海市农业科学院温室大棚，2017年12月1日进行种球采收，取围径24～26 cm 的种球放入木屑中储藏于9 ℃左右的冷库，2018 年3 月1 日取出种球定植于温室大棚中，正常水肥管理，2018年12月1日再次种球采收，同样方式储藏于冷库中。2018 年1～12 月种球所处环境平均温度见图1，其中温度较高的月份为7～8 月，较 低 的 月 份 为 冷 库 贮 藏 期1、2 和12月。

图1 试验期间各月份朱顶红种球所处环境平均温度Fig.1 Average temperature of the environment H.hybridum bulbs placed in during the experiment in each month

1.2 方法

2018年1月至12月每月28号取样3个种球进行解剖观测，将种球内当年抽出的第1枝花序定义为F1（见图2），并以其所在层数为参照，将其内层所有花序从外至内依次定义为F2～F6，记录种球内≥0.05 cm（过小的花序难以从鳞茎盘上辨认出）的所有花序的长度大小，并对其内的花芽进行层层解剖，观测其花器官分化情况。

2018 年3～6 月，取样长度大小为0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 cm 的花芽，以及≥0.5 cm 的不同发育时期的花芽或其内花药与子房，进行FAA 固定和常规石蜡包埋，Leica RM2335 切片机切片，切片厚度8～12 μm，爱氏苏木精片染30 min，自来水水洗反蓝，经脱水透明封片后，在Nikon 光学显微镜下进行发育进程观测。

2 结果与分析

2.1 朱顶红花芽生长情况与花器官形态分化

2.1.1 花的形态特征

朱顶红为伞形花序，每花序具总苞片2枚。花序苞片内约着生4 朵花，每朵花具小苞叶1 枚（见图2：A～B）；花被片6 枚，内外各3 枚；雄蕊6 枚，花丝线性，花药椭圆形，花粉量较多；心皮3 枚，下位子房，花柱比雄蕊长，成熟时向上弯起，柱头3裂片张开近垂直于花柱（见图2：C）。盛开时总苞片与小苞叶均枯萎。

图2 ‘圣诞快乐’朱顶红花序结构与位置示意图A～B.蕾期花序形态与内部结构图；C～D.开花期种球内花序位置示意图（C.盛开的花序；D.种球解剖纵切图）；PH.总苞片；BR.小苞叶；f1～f4.花序内从大到小第1～4个花芽；F1.当年第1枝盛开的花序；F2～F4.以F1为参照，种球中从外至内层第2～4个花序；WF.前1年凋谢的花序Fig.2 Schematic diagram of the inflorescence structure and position in H.hybridum‘Merry Christmas’A-B.Inflorescence morphology and internal structure diagram during bud stage；C-D.Schematic diagram of inflorescence position in bulb during flowering period（C.Inflorescence in bloom；D.Longitudinal section of bulb）；PH.Phyllary；BR.Bracteole；f1-f4.The first to the fourth flower bud from large to small in the inflorescence；F1.The first inflorescence in bloom in the current year；F2-F4.Taking F1 as the first，the second to the fourth inflorescence from the outer layer to the inner layer of the bulb；WF.Withered inflorescences in the previous year

2.1.2 花的产生及周年生长情况

朱顶红鳞片为叶基部膨大形成，鳞茎盘为极度缩短的茎，合轴分枝方式，每产生3 枚筒状鳞片及1枚片状鳞片后，顶端分生组织即会向花序分生组织转化，其下腋芽继而萌发，并再次产生4 枚鳞片及1枝花序，此循环结构不断产生并逐渐将花序芽推向种球外层，同时花序内部小花芽花器官也在不断分化。

‘圣诞快乐’朱顶红一般于5 月左右抽出1～2枝花序并盛开，解剖发现此时种球内包含有3种花序：前1年凋谢的花序WF、当年盛开的花序F1、F2和第2 年将要盛开的花序F3、F4（见图2：C～D），花谢后7～12月的种球解剖发现当年还会产生第3 年将要盛开的花序F5、F6（见图3）。另外，周年生长观测（见图3）表明：当年会盛开的花序F1、F2 在盛开前的1～2 月冷藏期已生长至1.5～3.5 cm 左右，3月份定植后迅速抽出种球至5月底盛开，其中花序F2 在发育过程中因未知原因偶有干枯现象发生；第2 年将要盛开的花序F3、F4 在1～2 月冷藏期生长长度为0.15～0.5 cm，3 月份定植后至5 月底生长极为缓慢，之后6～9 月份生长较快，10～11 月生长变缓，增长至1.5～3.5 cm 进入冷藏期；第3 年将要盛开的花序F5、F6 分别于7 月底、8 月底在部分种球中肉眼可见（＞0.05 cm），之后其生长较为缓慢，至12 月冷藏期发育至0.15～0.5 cm，推测5～8 月可能是其花序原基产生的时间节点。

图3 不同月份种球内花序生长情况F1～F6.种球内第1～6花序，分别由紫色、红色、黑色、粉色、绿色、蓝色圆点指示；黑色箭头指示未开放的干枯花序Fig.3 Growth of inflorescences in bulbs each monthF1-F6.The first to sixth inflorescence in bulb，indicated by purple，red，black，pink，green，blue dots respectively；Black arrows indicate dried inflorescences that failed to open

对花序内花芽生长情况进行解剖观测，发现当花序长度发育至1.5 cm 时，其内最小花芽刚完成心皮原基分化，即完成花器官分化。结合花序周年生长情况可知‘圣诞快乐’朱顶红一年约产生2 个花序芽，之后2 个花序内花芽花器官分化过程较为漫长，直至翌年的7～8 月和9～12 月才分别完成。之后花序经低温作用后于第3 年抽出并开花（其中第2个花序可能干枯死亡），即整个花序的生命周期为1.5～2年。

2.1.3 花器官形态分化过程

朱顶红的花器官分化过程分为花原基分化期、外花被原基分化期、内花被原基分化期、雄蕊原基分化期和心皮原基分化期。花芽为0.02 cm左右时处于花原基时期，此时花器官未分化，生长锥细胞排列较密，细胞分裂较快（见图4：A～B）；花芽发育至0.05 cm 左右时，外花被原基分化，此时生长锥周边3 处隆起，但隆起高度并不一致，说明其分化并不同步，呈螺旋状向心式发生（见图4：C～D）；花芽发育至0.1 cm 左右时，内花被原基分化，分化位置为外花被原基内侧，与外花被相间排列（见图4：E～F）；花芽发育至0.2 cm左右时，雄蕊原基分化，椭圆球状，三角形排列，位置分别对应内外花被内侧（见图4：G～H）；花芽发育至0.3 cm左右时，3枚心皮原基分化，此时雄蕊原基上部已呈现出四棱状花药形态（见图4：I～J）；花芽发育至0.4 cm 左右时，3枚心皮原基还未闭合，下位子房的心室已经出现（见图4：K～L）；分化过程中内花被原基、雄蕊原基、心皮原基同样表现出大小不一致，因而也并非同步分化，说明所有花器官均为螺旋状向心式发生。

图4 ‘圣诞快乐’花器官形态分化A，C，E，G，I，K.花芽长度0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 cm 时石蜡纵切图；B，D，F，H，J，L.花芽长度0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 cm 时解剖观测图；A～B.花原基时期；C～D.外花被分化期；E～F.内花被分化期；G～H.雄蕊分化期；I～J.心皮分化期；K～L.心室分化期；FP.花原基；OPP.外花被原基；IPP.内花被原基；SP.雄蕊原基；CP.心皮原基；VE.心室Fig.4 Morphological differentiation of the flower organs in H.hybridum‘Merry Christmas’A，C，E，G，I，K.Paraffin longitudinal section of flower buds with lengths of 0.02，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4 cm；B，D，F，H，J，L.Anatomy observation of flower buds with lengths of 0.02，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4 cm；A-B.Flower primordium differentiation stage；C-D.Outer perianth differentiation stage；E-F.Inner perianth differentiation stage；G-H.Stamen differentiation stage；I-J.Carpel differentiation stage；K-L.Ventricle differentiation stage；FP.Flower primordium；OPP.Outer perianth primordium；IPP.Inner perianth primordium；SP.Stamen primordium；CP.Carpel primordium；VE.Ventricle

2.2 小孢子发生与雄配子体发育过程

2.2.1 花粉壁发育

朱顶红花药4 室，中间有药隔（见图5A）。早期发育时期，花药表皮下孢原细胞进行平周分裂产生2 层细胞，外层发育为初生壁细胞，内层发育为造孢细胞。初生壁细胞继续进行平周分裂产生外层次生壁细胞与内层次生壁细胞，内层次生壁细胞在功能上继续发育形成绒毡层，外层次生壁细胞再次进行1～2 次平周分裂并继续发育成药室内壁和中层（见图5B）。成熟的中层细胞有2 层，因药室内壁与中层有共同的起源，根据Davis 的被子植物胚胎分类标准，朱顶红花粉壁发育属于双子叶类型。当小孢子母细胞发育成熟时，花粉壁也发育完全，共有4层结构，由外至内为表皮、药室内壁、2 层中层、绒毡层（见图5C）。随后小孢子母细胞进入减数分裂期，同时中层细胞开始解体，绒毡层继续发育（见图5C）。减数分裂细线期时，绒毡层形成多核结构（见图5D），发育达至顶峰，之后开始退化。当减数分裂完成并形成单核靠边期花粉粒（小孢子）时，绒毡层与中层细胞已大部分退化（见图5G），因绒毡层原位解体，并未进入药室中，从解体过程来看，朱顶红绒毡层为分泌型绒毡层。当2-细胞花粉粒形成时，绒毡层与中层细胞已完全退化，表皮细胞也已退化或仅留残迹，花粉壁细胞只余药室内壁，且药室内壁径向加长，发生纤维化加厚，同侧两个花粉囊交接处未加厚，在拉力作用下相通为一室（见图5I）。花粉成熟后，花粉囊完全打开至横截面呈H型并散粉（见图5K）。

图5 ‘圣诞快乐’小孢子发生和雄配子体发育过程A.幼花横切；B.外层次生壁细胞发育为药室内壁和中层；C.花粉壁结构；D.减数分裂细线期；E.四分体时期；F.单核花粉粒时期；G～H.单核靠边期；I～J.2-细胞花粉粒时期；K～L.花粉成熟期（黑色箭头示成熟花粉粒）；en.药室内壁；ep.表皮；gc.生殖细胞；il.内层次生壁细胞；m.中层；mm.小孢子母细胞；mp.单核花粉粒；ol.外层次生壁细胞；sc.造孢细胞；ta.绒毡层；vc.营养细胞Fig.5 Microsporogenesis and male gametogenesis development in H.hybridum‘Merry Christmas’A.Transection of the tender flower bud；B. Outer layer of secondary wall cells develop into endothecium and middle layer；C.Structure of pollen wall；D.Meiotic fine line stage；E.Tetrad stage；F.Mononuclear pollen grain stage；G-H.Mononuclear marginal stage；I-J.2-celled pollen grain stage；K-L.Pollen mature stage（black arrow shows the mature pollen grains）；en.Endothecium；ep.Epidermis；gc.Germ cell；il.Inner layer of secondary wall cell；m.Middle layer；mm.Microspore mother cell；mp.Mononuclear pollen grains；ol.Outer layer of secondary wall cell；sc.Sporogenous cell；ta.Tapetum；vc.Vegetative cell

2.2.2 小孢子发生与雄配子体发育

在花粉壁发育的同时，花粉囊内的初生造孢细胞经多次有丝分裂后形成次生造孢细胞（见图5B），并随后直接发育成小孢子母细胞（见图5C）。小孢子母细胞的体积较大，呈多边形或不规则形状，细胞核大，细胞质浓。之后小孢子母细胞进入减数分裂期，第一次减数分裂后形成二分体，第二次减数分裂后形成四分体，为十字交叉型（见图5E）。朱顶红小孢子发生中的减数分裂属于连续型胞质分裂。四分体在绒毡层分泌的胼胝质酶作用下互相分离，并最终形成4 个单核花粉粒，即小孢子（见图5F）。

刚刚游离出的小孢子，细胞质浓，细胞核位于细胞中央（见图5F），之后不断吸收解体的绒毡层营养，细胞迅速变大，细胞质中形成了中央大液泡，细胞核随之移到细胞一侧，形成单核靠边期花粉粒（见图5H）。随着花粉粒的发育，DNA 经过一次复制后，通过不均等胞质分裂，形成两个大小不同的细胞，大的为营养细胞，小的为生殖细胞。接着生殖细胞内缩脱离开来，游离于营养细胞中（见图5J），以后生殖细胞不断拉长，形成纺锤状精细胞，花粉壁不断发育，积累孢粉素，逐渐形成特殊雕纹和萌发孔，并最终发育为成熟的2-细胞型花粉粒，即雄配子体（见图5L）。

2.3 大孢子发生与雌配子体发育过程

朱顶红为3 心皮，3 心室，中轴胎座，每室两列倒生胚珠，具内外双珠被，外珠被由多层细胞构成，内珠被由2～3 层细胞构成（见图6：A、H）。胚珠原基发生于心皮的腹缝线处（见图6A），随后在表皮下产生了1 个孢原细胞（见图6B），孢原细胞经平周分裂为2 个细胞，外层为周缘细胞，之后垂周分裂形成珠心细胞，内层为造孢细胞，不经分裂直接发育为大孢子母细胞，因大孢子母细胞与表皮之间有一层珠心细胞，因而为厚珠心类型（见图6C）。与此同时，珠心基部发生突起，并逐渐生长形成珠被。之后大孢子母细胞继续发育，并从珠心细胞中吸收营养，最终珠心细胞逐渐退化消失，珠孔位置只余表皮一层（见图6：D～G）。

图6 ‘圣诞快乐’大孢子发生和雌配子体发育过程A.幼花子房横切；B.孢原细胞期；C.大孢子母细胞时期；D.第一次减数分裂期（白色箭头示退化珠孔端细胞，黑色箭头示功能合点端细胞）；E.二孢子胚囊期；F.四核胚囊期；G.八核胚囊期；H～L.成熟胚囊期；an.反足细胞；ar.孢原细胞；eg.卵细胞；me.大孢子母细胞；op.胚珠原基；pn.极核；sy.助细胞；nc.珠心细胞Fig.6 Megasporogenesis and female gametogenesis in H.hybridum‘Merry Christmas’A.Transection of the ovary of the tender flower bud；B.Archesporium cell stage；C.Megaspore mother cell stage；D.First meiosis stage（white arrow shows the degenerate cell in the micropylar end，black arrow shows the functional cell in the chalazal end）；E.Dispore embryo sac stage；F.Four nuclear embryo sac stage；G.Eight nuclear embryo sac stage；H-L.Mature embryo sac stage；an.Antipodal cell；ar.Archesporium cell；eg.Egg cell；me.Megaspore mother cell；op.Ovule primordium；pn.Polar nuclei；sy.Synergid；nc.Nucellus cell

大孢子母细胞进入减数分裂期后，第一次减数分裂形成2核细胞，其中靠近珠孔端的核细胞逐渐退化消失（见图6D），合点端核细胞进入第二次减数分裂，并形成2 个大孢子（见图6E）。因而朱顶红胚囊发育类型为双孢子葱型胚囊。2 个大孢子分别移动至珠孔端与合点端，并进行有丝分裂形成4核细胞，其中2个位于珠孔端，2个位于合点端，形成4核胚囊（见图6F）。接着4个核细胞再次通过有丝分裂直接产生8 核胚囊（见图6G），并伴随着核的分裂，胚囊体积显著增大，尤其在长轴方向，之后两端各有一个细胞核移向中央，互相靠近形成极核（见图6K），而珠孔端的3 个细胞进一步发育为2 个助细胞（见图6I）和1 个卵细胞（见图6J），共同构成卵器，合点端的3个细胞发育为反足细胞（见图6L），最终形成7细胞8核成熟胚囊。

3 讨论

3.1 朱顶红的花芽分化与发育特点

朱顶红花芽分化呈现连续分化特点，每产生3枚筒状鳞片及1枚片状鳞片后，顶端分生组织即会向花序分生组织转化，之后其下腋芽萌发，并同样产生4 枚鳞片及1 枚花序芽，这一循环结构表明朱顶红营养性顶端向生殖性顶端的转变似乎并不受外界环境的影响，而具有内在的自然节律。

在上海地区设施栽培条件下对‘圣诞快乐’朱顶红花芽生长观测结果表明：‘圣诞快乐’一年产生2 个花序芽，第1 个花序的花器官分化至第2 年7～8月完成，第2个花序的花器官分化至翌年9～12月完成，之后经过低温作用于第3 年抽出并开花，单个花序的生命周期为1.5～2 年，其中第2 个花序有一定几率败育。这与吴永朋等在西安地区对3 个朱顶红品种的研究结果比较一致。但考虑到朱顶红有些品种每年抽出花序为1～2 枝，有些品种每年抽出花序为2～3 枝，并结合Doorduin、原雅玲等研究结果，可推知朱顶红的花序芽分化数量、败育情况受品种类型和栽培温度影响较大，在我国中部地区气候条件下不同品种每年的花序芽分化数量应为2～3 个，其败育情况因品种而异。

冷藏期时‘圣诞快乐’朱顶红种球中花序芽有4 枚左右，经低温作用后在次年5 月底却只能抽出1～2枝。在Doorduin等的研究中认为＞2 cm的花序芽为潜在开花芽，但并未提供数据证明。在本研究中发现1.5 cm 左右的花序芽刚刚完成其内花芽花器官分化，推测花序能否接收低温信号并诱导开花与花器官分化进程是否结束有关，下一步将会进行相关试验验证这一推论。另外，周年观测发现9 月份左右‘圣诞快乐’种球中第1 个花序已普遍发育至2 cm 以上，前期研究发现此时采收种球进行低温贮藏60 d，之后种植于加温大棚中即可促成早花，但提前采收种球也可能导致第2个花序无法正常萌发，导致开花花序数量减少，因此在生产实践中可根据具体需求决定是否通过此法来进行花期调控。

不同季节的朱顶红种球内有2～4个花序，其内花芽花器官分化进程均不相同，本研究通过解剖和石蜡切片观测确定了不同大小花芽所处的花器官分化进程，为花器官发育研究提供理论依据。

3.2 朱顶红胚胎学特征及系统学意义

朱顶红雄蕊6 枚，花药4 室，花药壁发育类型为双子叶型，从外至内由表皮、药室内壁、中层和绒毡层组成，绒毡层类型为分泌型，小孢子胞质分裂类型为连续型，四分体排列方式为十字交叉型，成熟花粉粒为2-细胞型；朱顶红3 心皮，3 心室，下位子房，中轴胎座，两列倒生胚珠，胚珠为双珠被，厚珠心，胚囊发育类型为双孢子葱型。

胚胎学特征是植物判断亲缘关系、系统进化进程以及植物分类的重要依据。比较朱顶红属与石蒜科的水仙属、葱兰属、石蒜属的胚胎学特征（见表1），发现它们具有许多相同的特征：花药4 室、药室内壁纤维状加厚、分泌型绒毡层、连续型减数分裂、倒生胚珠、双珠被、下位子房。说明这几个属的确亲缘关系较近。其不同特征主要在于花药壁发育类型、花药壁中层细胞层数、小孢子四分体类型、成熟花粉类型、珠心类型和胚囊发育类型。一般认为2-细胞型花粉、厚珠心为较为原始的特征，而葱型胚囊为较为进化的特征，朱顶红属植物即具有相对原始又具有相对进化的特征，因此认为朱顶红属在石蒜科中属于由原始向进化过渡的类群。

表1 朱顶红属与水仙属、葱兰属、石蒜属胚胎学特征比较Table 1 Comparison of embryological characters among Hippeastrum，Narcissus，Zephyranthes and Lycoris

植物的生殖发育是植物个体增多，居群扩大，遗传多样性改变的主要方式。生殖过程中雌雄性细胞的正常发育是生殖成功的重要环节。目前朱顶红的育种过程中发现不同品种的结实率差异较大，部分品种表现出生殖败育。‘圣诞快乐’朱顶红是一个自交、杂交结实率均较高的品种，对其小孢子发生和雌雄配子体发育过程进行观测，可以为生殖败育品种的相关过程研究提供参考，为败育原因的探讨提供理论基础。