白酒风味物质研究进展及关键技术分析

吴成林，胡家艺，张惟广

（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

白酒是我国传统发酵饮品，已有上千年历史，是世界六大蒸馏酒之一。白酒中水和乙醇占比为98%～99%，剩余1%～2%为白酒中各种微量物质，而这些微量物质是影响白酒呈香呈味的关键性成分，决定了白酒的品质分级[1]。随着生产工艺的优化，白酒香型在清香型、酱香型、浓香型为主香型基础上，又相继增加了芝麻香型、兼香型、米香型、凤香型、老白干香型、馥郁香型、药香型、豉香型、特香型等9种香型，对风味研究的需求更加迫切[2]。微量成分的研究不仅可以提升白酒口感风味，还能为白酒生产过程中菌种的选择、酿酒原料的选择等提供参考[3-4]。现有白酒挥发性成分分析主要对关键风味物质进行筛选，产生了气相色谱-闻香（gas chromatography-olfactometry，GC-O）的研究方法，形成了以“感官导向分离”为核心的“感官组学”的研究体系[5]。本文对白酒风味物质的筛选技术以及白酒风味成分研究进展进行综述，旨在为白酒风味研究和技术发展提供参考。

1 白酒风味物质研究进展

从1964年中国轻工业部设定试点开始，现代化白酒微量成分的研究已经有将近60年的历史[6]，期间从纸层析色谱法到气相色谱技术再到全二维气相色谱飞行时间质谱技术（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）用了40多年的时间，鉴定出的香味成分也由最初的50多种到2017年的1 874种[7-9]。2007年以后，运用气相色谱质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、GC-O、气相色谱结合火焰光度检测器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）等技术检测白酒风味越来越普及。特别是GC×GC-TOFMS在白酒风味检测中的应用，将检测出的微量成分数量提升了一个数量级。季克良等[10]通过全二维气相色谱/飞行时间质谱联用检测技术对白酒微量成分进行检测，鉴定出酱香型、浓香型、清香型白酒的组分数量分别达到了873、342、178种。徐占成等[11]通过搅拌吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）技术和GC×GC-TOFMS联用对白酒进行香味成分鉴定，分别从酱香型白酒、清香型白酒中检测出1 700、1 300种左右的微量成分，另外从某品牌白酒中检测出1 870组成分，其中准确定性出1 227种微量成分。随着现代技术的发展，白酒微量成分检测效率提高很快。因此，将多种现代先进检测技术引用到白酒风味领域进行分析检测是非常必要的。

1.1 顶空固相微萃取技术在白酒风味研究进程中的应用

张丽敏等[12]首次将气相色谱技术和氢火焰离子光度检测器相结合用来检测清香型白酒酒体香型和微量成分，发现随着时间的延长，低沸点、低水溶性的酯类物质逐渐减少，而高沸点且水溶性强的物质如酸、醇、羰基类化合物则逐渐增加。张五九等[13]将顶空固相微萃取技术结合气相色谱质谱技术对豉香型白酒微量成分进行了定量分析，定量出的微量成分达到了118种，相比之前定量出的66种，多出了50多种。张明霞等[14]利用顶空固相微萃取与气质联用相结合的方法分析白酒香气物质组成，从白酒原酒中萃取到42种香气物质，其中包括酯类26种、酸6种、醇5种、醛2种、醚2种、酸酐1种。Zheng等[15]采用气相色谱-质谱联用技术对两种典型浓香酒的头、心、尾3个蒸馏阶段的36种原酒的挥发性成分进行了鉴定和半定量。在所有的酒中总共鉴定出63种化合物，结合主成分分析和偏最小二乘判别分析认为其中3-甲基丁醇、己酸、己酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、1，1-二甲氧基乙烷和1，1-二乙氧基-3-甲基丁烷是被测白酒中某两种白酒的主要风味物质，这也是首次将多元分析方法结合气相色谱-质谱技术对浓香型原酒进行鉴别。张媛媛等[16]采用液-液萃取、固相微萃取法结合气相色谱、气相色谱-嗅闻仪联及气相色谱-质谱联用方法分析芝麻香型白酒中含硫特征风味物质，检测到二甲基二硫醚、二甲基四硫醚、3-甲硫基丙醛、糠硫醇、二异丙基二硫、二糠基二硫醚和甲基甲烷硫代磺酸酯等物质。其中二甲基四硫醚、糠硫醇、二异丙基二硫、二糠基二硫醚和二甲基硫代亚磺酸酯是首次在芝麻香型白酒中发现。李贺贺等[17]采用顶空固相微萃取和搅拌棒吸附萃取技术结合气相色谱-质谱联用仪对酒样香气成分进行提取分析。共定性出190种化合物，其中用标准品准确定性143种。在白酒中首次发现4种酯类化合物:3-甲基丁酸己酯、丁酸辛酯、癸酸丙酯、癸酸异丁酯。郝飞龙等[18]通过顶空固相微萃取、液液萃取结合气相色谱质谱技术、GC-FID技术，对3个系列的白酒定性、定量分析，共定性、定量出57种香气化合物，3种酒共有的化合物有51种。通过香气活性值（odor activity values，OAV）计算，酯类、脂肪酸类、醇类化合物的含量相对较高，是主要的香气组成成分。Jin等[19]采用顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用仪，通过冗余分析揭示了微生物群落与酱香型风味酒挥发性特征之间的相关性。证明了杆菌与吡嗪类密切正相关，乳酸菌与酯类密切正相关，曲霉与吡嗪类、酯类和芳香类之间的相关性。Zhu等[20]应用气相色谱-嗅觉法、气相色谱质谱法、火焰光度法、氮磷检测法和气味活度法对白酒中重要的硫、氮化合物进行了表征，3个样品中分别含有60、62、61个芳香贡献化合物。结果表明，2-甲基-3-呋喃硫醇（OAV:20～30）、3-巯基乙酸酯（OAV:13～20）、丁马马酮（OAV:30～57）、（E）-2-壬烯醛（OAV:9～22）、庚醛（OAV:4～13）、己醛（OAV:9～12）和2-异丙基-3-甲氧基吡嗪（OAV:4～14）对酒的香气有促进作用。这是国内首次采用火焰光度检测器和氮磷检测器对酒中含量较低的硫、氮化合物进行测定。Ma等[21]采用顶空固相微萃取和同步蒸馏萃取法分别对药酒中挥发性成分进行了提取，并用气相色谱-质谱和气相色谱-嗅觉法对其进行了定性和定量分析。通过GC-MS共鉴定出133种挥发性化合物，包括酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、呋喃类、萜类和其它杂类化合物。共有66个芳香活性化合物被GC-O进一步识别，其中43个由于OAV值较高被确定为关键芳香化合物。

从2002年发展至今，顶空固相微萃取技术作为一种运用广泛、便捷的前处理技术，它可以结合不同前处理技术和检测方法，检测出大量的、未知的化合物质，也能对不同香型白酒的特征风味物质进行鉴定、定性定量不同组分以及验证微生物种类和白酒风味之间的关系。顶空固相微萃取技术的使用大大加快了白酒风味的研究进程，因此探索出更多的前处理技术和检测方法，提高顶空固相微萃取技术的使用范围变得尤为重要。

1.2 白酒感官分析发展

范文来等[22]依托“169”计划，按照国际环境条件，参考阈值测定美国国家标准，制定出国际领先的“中国白酒风味物质嗅觉阈值测定方法体系”，并成功测定出包括酯类、醇类、醛类、脂肪类、吡嗪类、呋喃类等77种物质的嗅觉阈值，这给后来的研究人员对白酒的风味轮廓图描绘奠定基础。刘明等[23]借鉴感官科学分析原理和描述词引用频率方法，首次验证了感官描述分析技术客观评价白酒风味的可行性，为白酒风味轮的建立提供研究基础。此后随着GC-O技术结合香气萃取稀释分析法（aroma extract dilution analysis，AEDA）、香气强度分析法以及香气活性值的综合运用[21，24-25]，通过将人体感官与仪器检测相结合，使对白酒风味的分析结果更真实、全面。白酒风味分析得到了长足的发展，截至目前为止，已发现的白酒风味物质达到了2 000多种[26]，其中确定浓香型的主体香是己酸乙酯，浓香型白酒中的己酸乙酯的OAV均大于500，同时发现丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯等酯类也起着较大的作用[27]；清香型的主体香是乙酸乙酯，比较重要的风味化合物有辛酸乙酯、己酸乙酯、2-羟基-3-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁醛，其中辛酸乙酯为清香型白酒特有的香气成分[28]。而酱香型的主体风味物质还没有被探究出来，但相较于其它几种香型来说，由于其成分的复杂性，它的主体香可能不是由单一的某种物质组成，而是由多种极微量成分共同决定的[25，29-31]。

主体香并不仅是由风味成分的绝对含量决定的，还与它的阈值相关，如土味素、β-大马酮等化合物含量只有10-9g/mL左右，但因其阈值较低对整体风味也会产生影响[32]。不同香型白酒的主体香和关键风味物质的确定，对我国白酒生产工艺的改进、对白酒品质稳定以及白酒产业的发展都具有极大的促进作用。感官分析方法的不断进步，结合现代高科技手段，使得白酒风味检测技术愈发完善。

2 关键技术分析

白酒的风味成分分析主要是检测一些极其微量的成分，所以往往需要先将这些微量成分先从水和乙醇中提取出来，运用GC-MS或GC-FID分析检测，之后结合GC-O与AEDA、时间-强度法（odor specific magnitude estimation，OSME）联用等方法，将一些对风味起到重要作用的物质筛选出来，最后通过香气重组试验、香气缺失试验判定某一种或某一类物质对整体风味的贡献，白酒关键风味物质分析过程如图1所示。

图1 白酒关键风味物质分析流程图Fig.1 Flow chart of liquor key flavor substances analysis

2.1 前处理技术

白酒中的微量成分在检测前需要进行处理，目的是去除后续检测过程中的干扰成分，将微量成分浓缩富集便于检测。选择恰当的前处理方法能够节省检测时间、提高检测准确性。目前在白酒风味检测中运用较广泛的前处理技术有液液萃取法、顶空固相微萃取法[33-37]。液液萃取法先将需要检测的微量成分富集浓缩，再通过有机溶剂将其从基质中分离出来，所得成分较为完整，但在浓缩过程中可能会损失一些低沸点的挥发性物质[31]。范文来等[38]通过液液萃取和分馏技术结合GC-MS对绵柔型白酒进行分析，共检测出933个峰，其中鉴别出化合物672种，同时也是首次检测到萜烯与内酯类化合物。而顶空微萃取则对于这些低沸点物质具有较好的吸附效果，这两种方法互为补充，可以更好地将白酒中的微量成分从基质中较完整地提取出来。白酒风味检测前处理技术特点比较如表1所示。

表1 白酒风味检测前处理技术比较Table 1 Comparison of pre-treatment technology of flavor substances of liquor

2.2 检测方法

2.2.1 气相色谱-质谱检测

在白酒微量成分分析中，最常用的检测技术就是GC-MS，它的工作原理是气相色谱通过色谱柱对微量成分的吸附度不同进行分离，然后流出的微量成分先后进入质谱模块中的离子源形成离子，通过电场和磁场的作用将不同质荷比离子分开形成质谱，达到定性定量的目的[50]。GC-MS分离速度快、分离效果好且所需样品量少，因此在白酒、茶类产品等挥发性成分分析、血液和尿液中药物成分的检测、石油掺假检测中被广泛应用。在白酒风味检测中，Li等[51]用GC-MS、GC-O、GC×GC-TOFMS对芝麻香型白酒关键风味物质进行研究，苯甲醇是首次在白酒中被检测出来，被认为是一种新的对芝麻香型白酒风味有重要贡献的物质。但在白酒风味成分检测中，靠单一的气质检测并不能满足所有要求，由于存在检测限的问题，对于一些含量低于或者高于GC-MS检测限的微量成分则容易被漏检，所以对于一些含量高或者痕量成分的检测需要辅助其它方法，如GC-FID技术。

2.2.2 气相色谱与检测器联用技术

在白酒微量成分检测中，有时会有一些微量成分通过GC-MS等技术无法检测出来，此时气相色谱与单一检测器联用检测技术可以很好地解决这个问题。常见的气相色谱与检测器联用技术为气相色谱-火焰离子化检测器联用。火焰离子化检测器是一种高灵敏度检测器，对绝大多数有机物都有响应。郝飞龙等[18]运用GC-FID结合矫正因子法对3个系列的白酒进行定量分析，检测出酯类结合物中辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯含量较高；脂肪酸类化合物中2-甲基丙酸、丁酸含量较高；芳香族及酚类化合物中β-苯乙醇含量最高。常用离子化检测器使用范围见表2。

表2 常用离子化检测器使用范围Table 2 Application scope of common ionization detector

续表2 常用离子化检测器使用范围Continue table 2 Application scope of common ionization detector

2.3 风味物质定性、定量解析

2.3.1 定性分析

白酒微量成分定性分析中，最常用的方法是样品通过GC-MS谱库检索，通过谱库检索对待测物质进行初步定性，不同的谱库给出的检索结果会有少许偏差。经过初步定性后，就可以通过计算保留指数（retention index，RI），进行再次定性，该方法叫标准品定性法。其原理是通过在进样前，加入一定浓度的碳标混合物（C6-C30），进入质谱系统的碳标混合物会因为电场力与磁场力的共同作用而按自身重量依次流出，通过碳标能计算出未知化合物的RI，将计算得到的值与搜索文献查到的RI做比较，就能确定未知物的种类。最后还可以利用GC-O系统进行鉴定结果准确性，通过相同的升温程序和参数设置，对在固定出峰时间的化合物的气味比对，可以进行再次判断。

在用气相色谱-嗅觉测量法进行香味识别定性后，为了分析各种物质对白酒风味贡献度的大小，可采用GC-O结合OSME或者AEDA进行判定。OSME法是指将浓缩的样品经过嗅闻仪检测，其结果用香气强度表示。AEDA是将萃取浓缩后的样品与溶剂以一定比例梯度稀释后经嗅闻仪检测进行闻香识别，直至稀释到不能被识别为止，它的稀释倍数就是稀释因子（flavor dilution，FD）[31]。一般地，某挥发性成分的香气强度值或稀释因子越高，表明该组分对整体香气贡献度也越大。但由于白酒基质对香气识别有很大的影响，所以仅靠单纯的香气强度值或者稀释因子测定是不能准确反映白酒微量成分真实的风味贡献。所以就引入了香气活性值概念，香气活性值表示香气化合物的绝对浓度与该香气化合物的香气阈值浓度之比，用以表征某种香气化合物对香气贡献的大小，OAV≥1时，表示该物质对风味有贡献，数值越大表明贡献度越高[52]。香气活性值的计算，需要先测量未知物成分的含量，常用的定量分析方法有面积百分比法、归一化法、内标法、外标法。

2.3.2 定量分析

2.3.2.1 面积百分比法（峰高百分比法）

运行中每个峰的面积（峰高）占所有峰面积（峰高）总和的百分数，无需校正，能够实现简单、快速定量，要求：所需测定的组分的峰面积必须非常准确，各化合物在检测器上的响应相等并全部流出。

2.3.2.2 归一化法

与面积百分比法一样，都是计算出峰面积与总面积之比，归一化法定量的前提需要提前查询出所有待测微量成分的校正因子，且保证全部出峰且稳定。校正因子的使用是为了消除检测器对不同化合物的灵敏度不同对定量造成的影响，而面积百分比法默认校正因子为1。

2.3.2.3 内标法

将一种或几种内标物准确称量后加入到试样中，根据被测物和内标物的质量和色谱图上的峰面积比相等，计算各组分含量。该方法要求必须在样品中加入一个组分，易导致增加面积测量误差。内标物的选择要求：样品组分中不含有的物质、含量接近被测组分、出峰在中间位置且不与样品发生反应。白酒检测中常用的内标物有叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸等[53-54]。

2.3.2.4 外标法（定量进样-标准曲线法）

检测被测组分的纯物质来绘制浓度对响应值的标准曲线，然后测试被测样品中被测组分的响应信号（峰面积或峰高），通过标准曲线计算出其含量。该法操作简单，只需校正待测组分峰，但该方法要求进样量准确且仪器稳定性良好。

3 关键风味物质的确定

将多种OAV值、FD值较大的化合物初步认定为对风味有突出贡献的物质，但不同的化合物之间存在着相互作用的关系，从而导致一种（类）化合物对另一种（类）化合物香气的增强或削弱。Lytra等[55]通过将4种红酒酯类物质丙酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯、乙酸丁酯和2-甲基丙酯在重组酒样中缺失，验证其对红酒果香的影响，结果表明3-羟基丁酸乙酯和2-甲基丙酯缺失后，红酒果香味减弱，表明它们在提高红酒整体果香强度方面具有增强作用。杜静怡等[56]通过风味重组试验首次确认月桂酸乙酯和3-甲硫基丙醇是清香型白酒的重要香气组分。所以，关键风味物质的确定，需要结合风味重组、风味缺失、风味添加等试验方法，以排除白酒基质对风味物质的影响以及风味化合物之间的相互影响。

4 展望

随着越来越多的新技术被应用到白酒挥发性风味物质的研究中来，在探索出更多未知的风味物质的同时，仍需要在许多方面进行深入探索。持续对前沿检测技术进行探究，类似电子鼻、电子舌以及气相色谱-嗅闻-质谱联用等技术，对白酒风味物质检测过程发挥着越来越重要的作用。对于白酒中检测出来数量庞大的风味物质对人体作用的利弊，需要结合中医学、营养学等进行判定，同时利用宏基因组学、代谢组学等手段，探索各种微生物在发酵生产过程中对这些风味物质的产生起到的作用。通过结合不同学科知识进行白酒风味解析，达到优化白酒生产工艺，提升白酒品质的目的。现有白酒关键挥发性风味物质的研究是白酒风味学的一个分支，对于白酒中难挥发性物质对其它物质作用的研究，以及在白酒品尝过程中口腔温度对风味感知的影响，需要结合人体感知和生理特性。此类相关研究在国内报道较少，将是未来白酒风味研究的发展方向。