气流分级对发芽小麦粉面筋蛋白特性的影响研究

齐笑笑，郭嘉，温纪平

（河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

小麦是三大传统谷物之一，是主要的粮食作物。小麦中富含多种营养物质，但由于天气原因、贮藏条件不当等因素，小麦吸水受潮后品质会发生劣变，如内部酶活性升高，总淀粉、粗脂肪和蛋白质含量减少，出粉率、灰分、千粒重和容重降低[1-2]。随着发芽程度的加深，面筋越来越弱，面团易流变，小麦加工品质和食用品质明显下降，导致价格降低[3]，且多用作饲料生产，造成巨大的经济损失和资源浪费[4]。研究表明，小麦发芽过程中蛋白酶活性增强易导致大部分的蛋白质水解，蛋白质分子结构变得更加疏松，部分大分子蛋白质转变成小分子蛋白质，使清蛋白、球蛋白含量增加[5]；另外萌动也会使-SH、S-S含量减少、氨基酸含量增加、面筋蛋白的功能特性如持水力、持油力升高[6]。

解决发芽小麦品质劣变的问题，一方面可以通过培育抗穗发芽的小麦种子[7]；另一方面可以从发芽小麦角度出发，对芽麦进行不同手段的处理，来改善发芽小麦品质，主要包括微波辐照、加热处理、添加酶抑制剂、剥皮制粉、配粉配麦等[8]。但现有的处理手段具有一定的局限性，如剥皮制粉易使碎麦麸进入面粉而降低其质量，配粉配麦需要利用正常小麦，微波处理和热处理会对蛋白质造成不利影响。气流分级是一种对组分无破坏的物理方法，可以有效改善萌动小麦粉的品质[9]。该法利用颗粒粒径不同在空气中受到的气体曳力、自身重力和离心力的综合作用不同，将粗粒沉降细粒带走，从而对不同粒径的颗粒实现分级[10]。

本研究对小麦进行发芽处理，分别得到未发芽小麦粉（WF）和发芽小麦粉（SF），并对SF进行气流分级后按照粒径大小分为F1、F2和F3，共5种小麦粉，以此为原料，通过对其蛋白质含量、面筋指数、巯基二硫键含量、面筋蛋白的功能特性、动态流变学特性、氨基酸含量等进行测定分析，探究气流分级对发芽小麦粉面筋蛋白特性的影响规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百农307：河南秋乐种业科技股份有限公司；L-半胱氨酸、β-巯基乙醇、Tris、甘氨酸、5，5-二硫代-2-2硝基苯甲酸 （5，5-dithio bis-2-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA）：上海麦克林生化科技有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulphate，SDS）：北京索莱宝科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、盐酸、硼酸、尿素、氯化钠、氢氧化钠、无水乙醇：天津市科密欧化学试剂有限公司。以上均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LRH-550-S恒温恒湿培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司；MLU-202型布勒实验磨：瑞士布勒集团；AF200气流分级机：山东潍坊精华粉体工程有限公司；NKT-2010L激光粒度分析仪：山东耐克特仪器有限公司；HFQ型面粉混合器：开封海德机械有限公司；HJ-6磁力加热搅拌器：金坛市西城新瑞仪器厂；THZ-82A水浴恒温振荡器：金坛市杰瑞尔电器有限公司；LXJ-IIB离心机：上海安亭科学仪器厂；UV2150紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；FOSS TM8400凯氏定氮仪：丹麦FOSS仪器公司；Freezone6 plus冷冻干燥机：美国Labconco有限公司；S-433D氨基酸分析仪：德国SYKNM公司；MARS60哈克流变仪：美国Thermo Fisher Scientific公司；VTMR20-010V-T型核磁共振变温分析系统：上海纽迈电子科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

发芽小麦制备：将除杂后的小麦籽粒室温（25℃）下浸泡4 h，沥干水分后铺在托盘上，放入恒温恒湿培养箱中于 20℃、相对湿度（relative humidity，RH）85%条件下培养12 h，将发芽好的小麦放入45℃的电热恒温鼓风干燥箱中干燥12 h，使水分降到13%以下，室温（25℃）保存。

小麦粉制备：小麦在室温（25℃）下润麦，加水调质约24 h，目标水分为15%。采用MLU-202型布勒实验磨磨粉，收集各系统粉混匀，控制出粉率在70%左右。将部分发芽小麦粉（SF）进行气流分级，得到3种不同粒径的发芽小麦粉（F1、F2、F3），5种粉的粒径分布见表1，相同环境下密封保存于4℃冰箱中。

表1 5种小麦粉的粒径分布Table 1 Particle size distribution of 5 kinds of wheat flour

面筋蛋白制备：参考徐小青等[11]的方法，并略作修改，将小麦粉制成面团后，采用水洗法提取面筋蛋白，真空冷冻干燥48 h，用高速粉碎机粉碎后过80目筛，密封保存于4℃冰箱中备用。

1.3.2 蛋白组分的提取及蛋白含量测定

总蛋白含量的测定：参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中自动凯氏定氮仪法进行测定，系数为5.70。

谷蛋白大聚体（glutenin macropolymer，GMP）含量的测定：1.00 g小麦粉，加入20 mL 1.5%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulphate，SDS）溶液，旋涡振荡混匀，30℃水浴30 min，4 000 r/min离心15 min，弃上清液，用凯氏定氮法测定其含量，系数为6.25。

清蛋白含量的测定：1.00 g小麦粉加10 mL蒸馏水，50℃水浴30min，4 000 r/min离心20 min，收集上清液；蒸馏水洗沉淀2次，每次10 mL，50℃水浴10 min，4 000 r/min离心10 min，收集所有上清液，待测。

球蛋白含量的测定：上述沉淀用10%的氯化钠溶液提取，提取方法同清蛋白的提取方法。

麦醇溶蛋白含量的测定：沉淀用75%的乙醇溶液提取，提取方法同清蛋白的提取方法。

麦谷蛋白含量的测定：沉淀用0.2%的氢氧化钠溶液提取，提取方法同清蛋白的提取方法。

上清液收集合并后，用凯氏定氮法测定其含量，换算系数为6.25。

1.3.3 面筋含量和指数的测定

湿面筋含量的测定：参照GB/T 5506.2—2008《小麦和小麦粉面筋含量第2部分：仪器法测定湿面筋》测定；干面筋含量测定：参照GB/T 5506.4—2008《小麦和小麦粉面筋含量第4部分：快速干燥法测定干面筋》测定；面筋指数的测定：参照LS/T 6102—1995《小麦粉湿面筋质量测定法面筋指数法》测定。

1.3.4 面筋蛋白总巯基、游离巯基和二硫键含量的测定

参考郭兴凤等[12]的方法，并略作修改，绘制L-半胱氨酸标准曲线。用0.2 mol/L Tris-Gly缓冲溶液配制2 mmol/L L-半胱氨酸标准溶液，在412 nm处测定其吸光度，绘制标准曲线（吸光度为横坐标），得到y=0.076 3x+0.000 2，R2=0.999 5。

游离巯基（-SH）含量的测定：0.03 g面筋蛋白，溶于10 mL 0.2 mol/L Tris-Gly缓冲溶液，4 000 r/min离心15 min；取4 mL上清液，加0.1 mL 10 mmol/L的DTNB溶液，混匀后显色20 min，在412 nm处测定吸光度，通过标准曲线计算游离巯基的含量。

式中：y为样品在412 nm处吸光度对应的L-半胱氨酸浓度，μmol/mL；m为样品质量，g。

总巯基、二硫键含量的测定：取上述上清液1 mL，加入0.1 mL β-巯基乙醇和3 mL缓冲液，25℃下保温1 h；再加入10 mL 12%的三氯乙酸，再次25℃下保温1 h，4 500 r/min离心15 min；除去上清液，将沉淀用5 mL 12%的三氯乙酸洗涤两次后，溶于8 mL缓冲液，取4 mL上述溶解于沉淀的溶液，加入0.1 mL DTNB，混匀后显色20 min，在412 nm处测定吸光度。

式中：y为样品在412 nm处吸光度对应的L-半胱氨酸浓度，μmol/mL；m为样品质量，g。

1.3.5 面筋蛋白功能特性测定

持水力的测定：1.00 g面筋蛋白（m1）于50 mL离心管中，放入转子后称量总质量m2，加入25 mL蒸馏水磁力搅拌30 min，2 000 r/min下离心30 min，除去上层水分后称质量（m3），计算公式如下。

持油力的测定：2.00 g面筋蛋白（m1）用10 mL大豆色拉油搅拌，操作如持水力的测定，计算公式如下。

1.3.6 面筋蛋白动态流变学特性测定

参考黄莲燕等[13]的方法，并略作修改，按照1.3.3中仪器法测定湿面筋含量的方法洗出湿面筋，从中心部位取2 g左右湿面筋，揉成小球置于35 mm圆形平板中央，平板间距1 mm，用刮板刮去多余样品，频率变化范围为0.1 Hz～10.0 Hz，测试温度为30℃，应力为1%。用哈克流变仪测定其弹性模量（G′）、黏性模量（G″）和损耗角正切值（tan δ）随频率的变化。

1.3.7 面筋蛋白中氨基酸含量的测定

参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》进行测定。

1.4 数据处理

每个试验至少重复3次，试验结果表示为平均值±标准偏差。采用Excel和SPSS 20软件对数据进行分析和处理，采用Duncan极差法分析数据在P＜0.05水平上的显著性。采用Origin 8.0软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 蛋白质含量的分析

小麦中的蛋白质是重要的营养物质，气流分级对发芽小麦粉蛋白质含量的影响如图1所示。

图1 气流分级对发芽小麦粉蛋白质含量的影响Fig.1 The effect of air classification on the protein content of sprouted wheat flour

由图1可知，小麦发芽后，SF总蛋白含量显著降低，这是由于发芽会导致蛋白酶活性增强，将部分蛋白质水解成氨基酸或转化为酰胺来满足自身的生长需要，使蛋白质含量降低。GMP不溶于质量分数为1.5%的SDS缓冲溶液，GMP占总蛋白的比例不大，但与小麦的加工品质密切相关，可以用于面筋品质和面团特性的预测[14]。发芽前后和气流分级后GMP含量没有显著差异。

小麦中的蛋白质根据溶解性不同可以分为清蛋白、球蛋白、麦醇溶蛋白和麦谷蛋白。清蛋白和球蛋白是小分子蛋白，被称为生理活性蛋白，含有较高水平的氨基酸，不参与面筋网络的形成；而麦醇溶蛋白和麦谷蛋白是大分子蛋白，被称为面筋蛋白，参与面筋网络的形成。如图1所示，发芽后SF清蛋白含量升高，球蛋白含量无显著差异，麦醇溶蛋白和麦谷蛋白降低，这与金玉红等[15]的研究一致，说明在发芽过程中蛋白质处于不断分解与合成的动态。气流分级后，随着粒径的减小，F1、F2、F3清蛋白含量逐渐减少，球蛋白含量逐渐增加，麦醇溶蛋白与麦谷蛋白都是先增加再减小。说明清蛋白、麦醇溶蛋白和麦谷蛋白主要分布于大中粒径粉中，球蛋白分布在小粒径粉中。小麦胚乳中蛋白质含量从中心到皮层依次增加[16]，由此说明小粒径粉更接近于胚乳中心，而大中粒径粉更接近于皮层。

2.2 面筋含量和指数的分析

面筋是由麦谷蛋白与麦醇溶蛋白通过二硫键交联形成的凝聚物，面筋指数反映面筋的品质，面筋含量和品质是评价面团品质的重要标志[17]。气流分级对发芽小麦粉面筋特性的影响见表2。

表2 气流分级对发芽小麦粉面筋含量和指数的影响Table 2 The effect of air classification on the gluten content and quality of sprouted wheat flour

由表2可知，发芽后SF的面筋含量与面筋指数均降低；气流分级后，随着粒径的减少，F1、F2、F3的面筋含量与面筋指数均呈下降趋势，且F1的湿面筋含量和面筋指数与SF相比有显著升高，与WF相比也有升高。这是由于随着粒径的减小，蛋白质碎片流失，从而导致面筋含量降低[18]。面筋由麦谷蛋白和麦醇溶蛋白组成，其含量越高，面筋的品质越好，结合图1分析可知，随着麦谷蛋白与麦醇溶蛋白的比例减小，面筋品质变差，手洗面筋时难以成团，面筋含量也会降低。结果表明F1中面筋品质更好。

2.3 面筋蛋白总巯基、游离巯基和二硫键含量的分析

巯基的存在方式和含量与面筋的性质息息相关，二硫键是一种共价键，S-S的含量代表蛋白质结构的稳定性，S-S与还原酶作用会产生游离-SH，游离-SH对蛋白质的交联作用有很大影响，会破坏蛋白质构象的稳定性[19]。气流分级对发芽小麦粉中巯基、二硫键含量的影响见图2。

图2 气流分级对发芽小麦粉中巯基、二硫键含量的影响Fig.2 The effect of air classification on the content of sulfhydryl and disulfide bonds in sprouted wheat flour

如图2所示，发芽后，SF的总巯基、二硫键含量降低；气流分级后，随着粒径的减小，F1、F2、F3的总巯基与二硫键含量逐渐减少，且F1与WF相比有显著增加，F2、F3与SF无显著差异；游离巯基的含量先下降后上升。这说明随着粒径的减小，面团网络结构从稳定的S-S结构转变为不稳定的-SH结构，导致内部交联聚合紧密度的变化，面团中面筋网络结构变得疏松，面团强度变弱。结果表明F1中蛋白质的结构更加稳定。

2.4 面筋蛋白功能特性的分析

蛋白质的持水力是决定食品弹性和可塑性的主要因素，决定了蛋白质分子的内聚力和可分散性；持油力是蛋白质和脂类结合能力的表现，在不同的油脂中作用能力不同。气流分级对发芽小麦粉面筋蛋白持水力和持油力的影响见表3。

表3 气流分级对发芽小麦粉面筋蛋白持水力和持油力的影响Table 3 Effect of air classification on water holding capacity and oil holding capacity of sprouted wheat flour gluten

由表3可知，发芽后，SF的持水力和持油力均有增加，且持水力有显著差异；气流分级后，随着粒径的减小，F1、F2、F3的持水力和持油力逐渐增加，且F1、F2与WF无显著差异。这是由于在正常情况下，蛋白质分子中的带电基团和极性基团在分子内部无法与水或油结合。但在发芽后，蛋白酶活性升高，使部分蛋白质发生分解，这些基团被暴露出来，且随着粒径的减小更容易被暴露出来，从而加速与水或油结合，增强了持水力或持油力[20]。

2.5 面筋蛋白动态流变学特性分析

弹性模量G′又称储能模量，反映了弹性特征的减少量；黏性模量G″又称损耗模量，反映了黏性特征的增加量；损耗角正切值 tan δ 是 G″与 G′的比值，tan δ＜1表明在线性范围内的形变是可压缩和可恢复的，tan δ越小说明面筋体系聚合度越大或高聚物含量越多[21]。在固定应力下，通过改变振荡频率来观察面筋蛋白的G′和G″的变化。气流分级对发芽小麦粉面筋蛋白动态流变学特性的影响如图3所示。

图3 气流分级对发芽小麦粉面筋蛋白动态流变学特性的影响Fig.3 Effect of air classification on the dynamic rheological properties of sprouted wheat flour gluten

由图3可知，在0.1 Hz～10.0 Hz的频率扫描范围内，5种粉的面筋蛋白的G′和G″随着频率的增加整体呈增大趋势，且弹性模量始终大于黏性模量，说明表现出固体的性质。在同一频率下，F3的G′和G″均是最高的，说明F3的弹性变得越来越差，黏性越来越好，发生形变后不易恢复。如图3所示，随着频率的增加，WF、SF和F3的tan δ先减小后增大，F1和F2的tan δ逐渐增大，且均小于1。在同一频率下，发芽后SF的tan δ与WF相比增大了，说明SF面筋体系中的弹性比例变小，流动性变大，面筋强度下降，与2.2中面筋指数结果是一致的。

2.6 面筋蛋白中氨基酸含量的分析

气流分级对发芽小麦粉面筋蛋白中氨基酸的含量变化如表4所示。

表4 气流分级对发芽小麦粉面筋蛋白中氨基酸的影响Table 4 Effect of airflow classification on amino acids in gluten protein of sprouted wheat flour g/100 g

由表4可知，发芽前后与气流分级后，小麦粉中的氨基酸种类数量齐全，共检测到17种氨基酸，其中谷氨酸含量最高；在必需氨基酸中，亮氨酸含量最高。小麦发芽后，除半胱氨酸外，其余16种氨基酸含量均增加，这与龙杰等[22]的研究结果一致。气流分级后，F1的氨基酸含量是5种粉中最高的，F2、F3与SF相比没有显著变化，与WF相比有增加。赖氨酸作为小麦蛋白质的第一限制氨基酸，在发芽后增加，F1时达到最大值。这是由于小麦发芽后部分蛋白质受酶活性升高而水解为游离氨基酸，使氨基酸含量上升[23]。结果表明F1中营养价值更高。

3 结论

小麦发芽后，SF的总蛋白含量下降、清蛋白含量升高、麦醇溶蛋白与麦谷蛋白含量降低；面筋指数显著降低、总巯基与二硫键含量显著下降，面筋品质与蛋白质稳定结构变差；面筋蛋白的持水力和持油力升高，弹性下降、黏性上升；代表营养价值的氨基酸含量发芽后增加。

气流分级后，与 SF 相比，F1、F2、F3 的 GMP、球蛋白与麦醇溶蛋白含量均无显著变化，F1的总蛋白与清蛋白含量显著增加，F1面筋含量与指数升高、F2无显著差异、F3明显下降；F1的总巯基与二硫键含量显著增加，F2、F3无显著变化；F1的持水力和持油力显著下降、F2也有下降且二者与WF无显著差异，F3升高；F1与F2的弹性模量和黏性模量均下降，F3升高，且F1的tan δ低于SF；F1的大部分氨基酸含量呈增加趋势，F2与F3整体降低。

综上所述，小麦发芽后面筋含量、品质与蛋白质结构稳定性变差，面筋蛋白的功能特性、黏性与氨基酸含量升高，弹性降低；经气流分级后，F1的面筋品质变好、蛋白质结构更稳定、面筋蛋白弹性增加、黏性降低、氨基酸含量增加，其余指标与WF无显著差异。因此气流分级在发芽小麦上的应用值得更多研究。