气相色谱法同时测定慕萨莱思中甲醇和乙醇的含量

陈胜慧子，侯晓杰，乔通通，蒲云峰，2，侯旭杰，2*

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

慕萨莱思是具有新疆民族特色的传统饮品，有近千年的历史，传承着新疆刀郎文化的精髓与灵魂[1]。慕萨莱思酿造工艺与现代和传统葡萄酒酿造工艺存在着很大区别，其酿造过程一般为将新鲜葡萄（常用和田红葡萄）洗净、榨汁、熬煮浓缩后，经60 d左右自然发酵酿制而成[2-4]。根据个人口味及群体需求的不同，可以添加大芸、白杏、桑椹、红花、枸杞、鹿茸、红枣、枸杞等中药材[5]。慕萨莱思含有大量的醇类、糖类、有机酸、氨基酸等营养物质[6-7]，还含有原花青素、黄酮、花色苷、酚类等生物活性成分[8]。

近年来，随着人们对传统民族特色食品的青睐及消费市场需求的增加，慕萨莱思受到的关注也日益提升。目前，慕萨莱思的研究集中于酿造工艺优化[4]、菌种筛选及香气形成机理方面的研究[3，9]，而甲醇和乙醇作为慕萨莱思中极为重要的产品品质指标和安全性指标，对其研究报道较少。慕萨莱思相关企业以及监管机构，对于能够准确且同时测定甲醇和乙醇含量的方法的建立需求迫切。多位学者研究了葡萄酒、果酒等酒类中甲醇和乙醇含量的测定方法[10-11]，但通常仅限于单独测定样品中的甲醇或乙醇含量，鲜有建立同时测定甲醇和乙醇含量的方法。李惠明等[12]采用气相色谱法同时测定了桑葚酒中的甲醇和乙醇含量，但该方法采用外标法。在前期的研究中发现，气相色谱外标法的标准曲线线性关系差，结果不稳定。因此，建立一种简单、快速、准确，并且能够同时测定慕萨莱思中甲醇和乙醇含量的方法，对慕萨莱思以及其它酒类产品的质量和安全控制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与样品

无水乙醇（AR）：天津市致远化学试剂有限公司；异丙醇、甲醇（色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；样品：市售31个不同厂家的慕萨莱思产品，分别用M1～M31表示31个不同的慕萨莱思酒样。

1.2 试验仪器

气相色谱仪（GC-2014）[配有火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）]：日本岛津公司；电子分析天平（EL204-IC）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

KB-PLOT Q（30 m × 0.32 mm，10 μm）毛细管柱，进样口温度：250℃，检测器温度：250℃，载气为氮气，流量 1.0 mL/min，进样体积：1 μL，分流比为 50∶1，程序升温：初始温度为120℃，保持2 min，以10℃/min的速率升至170℃，保持3 min。

1.3.2 标准溶液配制

1.3.2.1 甲醇标准储备液（5 000 mg/L）

参考GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》[13]中甲醇储备液配制方法，略做修改。准确称取0.5 g（精确至0.001 g）甲醇至100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，混匀，4℃冰箱密封保存。

1.3.2.2 甲醇和乙醇混合标准工作液配制

参考GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》[14]和GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》[13]中标准溶液浓度范围配制，取6个100 mL容量瓶，分别吸取2.00、3.00、4.00、5.00、7.00、14.00 mL 无水乙醇，然后分别吸取1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、20.00 mL 甲醇标准储备液至容量瓶中，再用蒸馏水定容、混匀，现用现配。

1.3.3 标准曲线的制作

分别吸取10 mL甲醇和乙醇混合系列标准工作液于试管中，然后加入0.10 mL异丙醇，混匀，用0.22 μm针式滤膜过滤，测定甲醇、乙醇和内标异丙醇色谱峰面积，以甲醇浓度为横坐标，以甲醇和异丙醇色谱峰面积的比值为纵坐标绘制甲醇标准曲线；以乙醇浓度为横坐标，以乙醇和异丙醇色谱峰面积的比值为纵坐标绘制乙醇标准曲线。

1.3.4 慕萨莱思酒样测定

吸取试样10.0 mL于试管中，加入0.10 mL异丙醇，混匀，用0.22 μm针式滤膜过滤，注入气相色谱仪中，以保留时间定性分析，同时记录甲醇、乙醇和异丙醇色谱峰面积，再分别计算甲醇和异丙醇的色谱峰比值、乙醇和异丙醇的色谱峰比值，根据标准曲线分析慕萨莱思酒样中甲醇和乙醇含量。

1.4 数据处理

采用SPSS20.0对所有试验数据进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncan′s多重比较法分析，每个样品重复3次，试验结果表示为平均值±标准差，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 甲醇和乙醇的气相色谱检测结果

甲醇、乙醇混合标准品和慕萨莱思酒样的色谱图如图1和图2所示。

图1 混合标准品的气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of mixed standard

图2 慕萨莱思酒样的气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of the Musalais sample

甲醇（峰1）、乙醇（峰2）和异丙醇（峰3）的保留时间分别为4.07、5.34、7.09 min，在该分析条件下，甲醇、乙醇和异丙醇色谱峰的分离度远远大于1.5，说明该条件适合慕萨莱思中甲醇和乙醇含量的测定。

2.2 标准曲线

参照1.3.1的色谱分析条件，以甲醇和乙醇峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，甲醇和乙醇浓度为横坐标绘制标准曲线，以浓度最小的标准溶液逐级稀释，然后进样分析，通过信噪比的计算获得检测限（limit of detection，LOD，S/N=3）和定量限（limit of quantitation， LOQ，S/N=10），具体结果见表1。

表1 甲醇和乙醇的标准曲线Table 1 Standard curves of methanol and ethanol

由表1可知，甲醇和乙醇标准曲线的相关系数（R2）分别为0.999 5和0.999 3，表明在试验浓度范围内的线性关系良好。从检测限（LOD）和定量限（LOQ）分析，甲醇的检测限和定量限为2.34 mg/L和7.02 mg/L，而GB5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》[13]中的检测限和定量限分别为7.5mg/L和25mg/L[15]，说明该方法测定甲醇的检测限和定量限远低于国标要求，具有较高的灵敏度。李中贤等[16]采用气相色谱内标法建立了单独测定葡萄酒中甲醇含量的方法，其对甲醇的检测限为7.20 mg/L，高于本方法中的检出限。目前，尚无关于气相色谱法测定乙醇的检测限和定量限的相关报道，但从表1的结果可以看出，乙醇的检测限和定量限也较低。上述研究结果表明，采用目前条件所建立的方法分析慕萨莱思酒中甲醇和乙醇含量，方法的检测限低，灵敏度高，具有推广使用的价值。

2.3 稳定性

通过预试验，确定含有甲醇的慕萨莱思酒样，随机选取其中一个酒样（M23）进行分析，参照1.3.4的方法进行制备样品，采用0.22 μm针式滤膜过滤样品，准备5份相同的样品，分别在4℃的条件下放置0、6、12、18、24 h后进样，然后计算平均值、标准差及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2。

表2 稳定性试验结果Table 2 Results of stability test

由表2可知，在24 h内测定酒样中甲醇和乙醇含量的相对标准偏差分别为2.87%和1.79%，两者的相对标准偏差（RSD）均＜5%，表明该分析条件下，样品的稳定性较好，即在4℃的条件下放置24 h内，样品测定结果稳定。

2.4 精密性

以稳定性试验的慕萨莱思酒样（M23）为研究对象，参照1.3.4的方法进行样品制备，采用0.22 μm针式滤膜过滤样品，平行进样6次，记录甲醇、乙醇和异丙醇的峰面积，然后计算慕萨莱思酒样中甲醇和乙醇含量的平均值和RSD，结果见表3。

表3 精密性试验结果Table 3 Results of precision test

由表3可以看出，甲醇和乙醇的相对标准偏差分别为2.39%和1.71%，均小于5%，说明平行测定6次的结果误差较小，该方法的精密性和准确性较高。

2.5 回收率

以稳定性和精密性试验的酒样（M23）为研究对象，准确移取50mL酒样至100mL容量中，然后准确吸取一定量的1.3.2.1的甲醇标准储备液，再准确吸取一定量的无水乙醇，混匀后用蒸馏水定容，参照1.3.4的方法进行样品制备，采用0.22 μm针式滤膜过滤，每个处理重复6次，进样分析，计算回收率，结果见表4。

表4 回收率试验结果Table 4 Results of recovery test

由表4可以看出，甲醇、乙醇的回收率在93.18%～97.66%，回收率均超过90%，说明该方法分析慕萨莱思中甲醇、乙醇含量的回收率较好，可满足样品的定量分析需求，具备应用于实际生产的条件。

2.6 慕萨莱思酒样中甲醇和乙醇含量的测定

参照1.3.4的样品制备方法制备样品。然后按1.3.1的色谱条件进行分析，获得慕萨莱思酒样中甲醇和乙醇含量的结果，结果见表5。

表5 慕萨莱思酒样中甲醇和乙醇含量的对比Table 5 Methyl alcohol and ethanol contents in Musalais liquor samples

续表5 慕萨莱思酒样中甲醇和乙醇含量的对比Continue table 5 Methyl alcohol and ethanol contents in Musalais liquor samples

通过对31个慕萨莱思酒样中甲醇和乙醇含量分析可知，只有5个酒样中检测到甲醇，其中M7酒样中的甲醇含量最高，达（428.17±10.25）mg/L，且超过葡萄酒中甲醇的限量标准，国标中规定白、桃红葡萄酒中甲醇含量≤250 mg/L，红葡萄酒≤400 mg/L[13]。而其余4个检测到甲醇的酒样中甲醇含量远远低于GB 15037—2006《葡萄酒》中规定的甲醇限量，说明绝大部分慕萨莱思酒样中甲醇含量较低且符合国家标准。分析M7慕萨莱思酒样中甲醇含量异常的原因，可能是由于M7样品的原料中含有红枣，而红枣富含果胶和多糖，其在发酵过程中易产生过量的甲醇，进而导致M7酒样甲醇含量异常[17-18]。也有多位学者研究指出在以红枣为原料制备的发酵酒中甲醇含量较高，李坚等[19]采用新疆若羌红枣为原料制备红枣酒，其中甲醇的含量介于 336.95 mg/L～486.11 mg/L；黄孟阳[20]分析了红枣酒发酵过程中甲醇含量的变化规律发现，在发酵过程中其甲醇含量最高可达601.70 mg/L，采用一系列措施对甲醇生成量进行减控后可降低至223.40 mg/L。这均表明红枣作为原料生产发酵酒过程中，甲醇是其必然产物之一，因此极有必要建立简单有效的方法对其进行检测。从所测酒样的乙醇含量分析可知，该批慕萨莱思酒样的乙醇含量介于7.89%～14.55%，符合GB 15037—2006《葡萄酒》中乙醇含量要求（≥7%），但2/3的酒样实际乙醇含量与标签标识差异较大（＞0.5%），部分样品的乙醇含量与标识含量差异超过2%，说明目前慕萨莱思生产企业在产品的乙醇含量测定方面存在的问题较为严重，有必要建议企业开展检验人员培训或采用气相色谱法测定产品的乙醇含量。

3 结论

本研究采用KB-PLOT Q毛细管柱，建立了气相色谱法同时测定慕萨莱思酒样中甲醇和乙醇含量的方法，该方法与国标和文献方法相比较，既具备同时测定慕萨莱思酒样中的甲醇和乙醇含量，还具有样品处理简单、分析周期短、色谱峰分离度高、检测限和定量限低、结果稳定等优势，适用于慕萨莱思及其它果酒样品中甲醇和乙醇含量的同时测定。从样品分析结果来看，以葡萄为原料酿造的慕萨莱思的甲醇含量均符合GB 15037—2006《葡萄酒》中对甲醇含量的要求，但原料中含有红枣时，甲醇含量可能会超标；从慕萨莱思中乙醇含量的测定结果分析，所有样品均符合GB 15037—2006《葡萄酒》中乙醇含量要求，但实际测定结果与标签标识乙醇含量差异较大，这可能是由于慕萨莱思属于传统民族特色食品，实现工业化生产的时间较晚，企业对产品质量指标的检测方面重视程度不够。因此，有必要在慕萨莱思生产企业开展气相色谱法测定酒样中甲醇和乙醇含量的相关培训等工作，为促进新疆慕萨莱思产业的进一步发展助力。