响应面法优化碱性蛋白酶水解豆渣蛋白质的研究

郎佳雪，刘畅，赵淼，张茂迎，周云博，罗汇鸿，邹险峰，李险峰

（长春大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130022）

大豆中包含人体所需要的蛋白质、膳食纤维、碳水化合物等7种营养素，能够满足人类生命活动的需求[1]。大豆还含有多种有效成分，具有多种功能活性，如低聚糖可保护胃肠道、降低碳水化合物以及脂类的代谢，异黄酮和皂苷具有抗疲劳、预防癌症、骨质疏松等功效，能够满足人类医疗保健的需求[2-5]。蛋白质是大豆中一种重要的营养成分，含量达到40%左右，其中90%左右为可溶性蛋白，大豆蛋白质包含人体全部的必需氨基酸，其中赖氨酸含量丰富，与谷类主食形成互补，是一种优质的植物蛋白食源[6-9]。营养学研究表明，人类摄取植物蛋白和动物蛋白理想比例在儿童时应为1∶1，随年龄增长，植物蛋白摄取比例逐渐提高，在老年时达到 4∶1[10]。

目前市售大豆蛋白产品丰富，包括大豆分离蛋白、大豆组织蛋白和大豆蛋白粉等，并被添加到面制品、肉制品和乳品等各类食品中。大豆肽是大豆蛋白质的水解产物，分子小吸收率高，具有预防肥胖、降低血脂、调节免疫力、预防骨质疏松、缓解疲劳、延缓衰老等功能[11-12]，马福建等[13]研究表明大豆球蛋白水解肽具有清除超氧阴离子自由基和羟自由基的功能。杨柏崇等[14]研究表明大豆中β-伴大豆球蛋白被水解产生的大豆肽具有抗氧化的功能。证明了大豆肽具有抑制和清除体内自由基的作用，从而能够减少机体内自由基引发的生理功能障碍，减少各种老年性疾病的发生[15]。制备大豆肽的关键技术是蛋白质的水解，酶解法具有反应条件温和、不破坏氨基酸的结构、无副反应发生等优点，被食品工业广泛采用[16-17]。江连洲等[18]采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶水解制备大豆肽，结果表明碱性蛋白酶的水解能力最强。佟晓红等[19]研究表明碱性蛋白酶比风味蛋白酶水解产生的大豆肽清除自由基的能力强。因此本研究采用碱性蛋白酶，以水解度作为指标来评价豆渣蛋白的水解。

我国有加工食用大豆的传统，《本草纲目》中记载了“豆腐之法，始于前汉淮南王刘安”，已经开发出豆腐、豆浆、豆酱等多种大豆制品。目前我国已经成为世界上最大的大豆进口国和消费国，在2020年大豆进口量超过1亿吨。在豆制品加工过程中会产生大量残渣——豆渣，加工生产1吨豆腐会产生1.2吨湿豆渣[20]。由于大豆蛋白质中含有10%左右的不溶性蛋白，在加工过程中很难分离，会残留在豆渣中[21]。有研究表明，豆渣中残留的蛋白质含量达15.2%～33.4%[22]。新鲜豆渣中包含蛋白质、碳水化合物等营养成分能够给微生物提供充足的营养和湿度，故不易保存、易腐败、很难直接作为饲料应用。将豆渣作为废渣处理，不仅会对环境造成污染，同时造成部分大豆蛋白资源被浪费[23-24]。

为使豆渣蛋白得到合理利用，研究采用碱性蛋白酶水解豆渣蛋白，通过响应面法优化酶解工艺条件，获得大豆蛋白水解肽，通过DPPH法检测水解肽的抗氧化性。该水解肽可以应用于功能型饮料、面制品、调味品等食品和保健品中[25]。豆渣酶解后的剩余产物主要为纤维素成分，可进一步研究开发，实现大豆的完全利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜豆渣：市售；碱性蛋白酶（酶活力100000U/g）：无锡市酶制剂厂；2,2-联苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）：美国 Sigma公司；硫酸钾、硫酸、盐酸、次甲基蓝（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电热鼓风干燥箱（BGZ-146）:上海博讯实业有限公司；精密pH计（PHS-3C）：上海雷磁仪器厂；恒温水浴锅（HH6）：金坛市江南仪器厂；集热式磁力搅拌器（DF-1型）：金坛市新一佳仪器厂；循环水式真空泵(SHZ-DШ）：巩义市予华仪器有限公司；紫外分光光度计（UV2600）：日本岛津有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 豆渣前处理

新鲜的湿豆渣汽蒸30 min灭菌，50℃恒温干燥24 h，冷却至25℃，放置阴凉处备用。

1.3.2 豆渣蛋白质含量的测定

蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法[26]。

1.3.3 豆渣蛋白质的酶解流程及水解度的测定

称取1 g干燥豆渣，加入20 mL蒸馏水混合均匀配成液料比为20∶1（mL/g）的豆渣悬液，按照试验设计调节pH值，加酶，在恒温水浴锅中反应一定时间，反应结束后，100℃灭酶15 min，抽滤取上清液，用凯氏定氮法测定蛋白含量。

水解度的测定采用甲醛滴定法[27-28]，按如下公式计算。

1.3.4 单因素试验

pH值对水解度的影响：在液料比为20∶1（mL/g），水解温度为50℃，酶添加量为8 000 U/g，水解时间为3 h 的条件下，设定 pH 值为 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，测定其水解度。

水解温度对水解度的影响：在液料比为20∶1（mL/g），酶添加量为8 000 U/g，pH值为9.0，水解时间为3 h的条件下，设定水解温度为 40、45、50 、55、60 ℃，测定水解度。

水解时间对水解度的影响：在液料比为20∶1（mL/g），酶添加量为8 000 U/g，pH值为9.0，水解温度为50℃的条件下，设定水解时间为 1、2、3、4、5 h，测定其水解度。

酶添加量对水解度的影响：在液料比为20∶1（mL/g），pH值为9.0,水解温度为50℃，水解时间为3 h的条件下，设定酶添加量为 4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g，测定其水解度。

1.3.5 响应面试验

根据单因素试验确定最适条件进行四因素三水平的响应面试验，四因素三水平的设计条件见表1。

表1 响应面因素与水平Table 1 Response surface factors and levels

1.3.6 抗氧化试验

由于DPPH法[29]是目前公认的稳定且有效的抗氧化测定方法，因此采用DPPH法来测定抗氧化活性。在反应管中加入2 mL浓度为0.4 mmol/L DPPH-乙醇溶液，再加入2 mL不同浓度的豆渣蛋白水解肽液，混合均匀，25℃避光反应30 min后，在517 nm处测定吸光值。DPPH自由基清除率的计算公式如下。

式中：A0为2 mL无水乙醇+2 mLDPPH的吸光值；A1为2 mL样品溶液+2 mLDPPH的吸光值；A2为2 mL样品溶液+2 mL无水乙醇的吸光值。

1.4 数据处理

试验重复3次，运用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面设计和方差分析，Origin 2018软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 蛋白质测定结果

以干燥后的豆渣为原料，用凯氏定氮法测定干豆渣的蛋白质含量为21.25%。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 pH值对水解度的影响

酶解pH值对水解度的影响见图1。

图1 酶解pH值对水解度的影响Fig.1 Effect of pH value of enzymatic hydrolysis on degree of hydrolysis

由图1可知，随着豆渣pH值的增大，豆渣蛋白质的水解度先上升，当到达pH9.0以后呈现下降的趋势，可能pH值变化在一定程度上对碱性蛋白酶活性有一定的影响，因此水解大豆豆渣蛋白质的较佳pH值为9.0。

2.2.2 水解温度对水解度的影响

水解温度对水解度的影响见图2。

图2 水解温度对水解度的影响Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis

由图2可知，水解度在50℃之前，随着水解温度的上升呈现上升的趋势。说明随着水解温度的上升，碱性蛋白酶的酶活性也在逐渐变大；当水解温度为50℃时，豆渣的水解度达到最大，为91.35%，表明在50℃时碱性蛋白酶的酶活性最大；水解温度超过50℃后，豆渣蛋白质的水解度随着水解温度的升高而呈现下降的趋势，可能当达到一定温度后酶开始失活。由此可知温度过高或者过低都会影响碱性蛋白酶的酶活性。所以碱性蛋白酶在水解温度为50℃时达到较佳水解度。

2.2.3 水解时间对水解度的影响

水解时间对水解度的影响见图3。

图3 水解时间对水解度的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

由图3可知，水解前3 h豆渣蛋白质的水解度不断地上升，且速率较快，但是3 h之后水解速率降低，可能是水解至3 h时底物浓度和酶添加量之间达到了平衡，导致有些蛋白质的空间结构发生了变化，碱性蛋白酶失活影响了豆渣蛋白质的水解度[30-31]。考虑实际生产效率，碱性蛋白酶水解大豆豆渣蛋白质的时间为3 h较佳。

2.2.4 酶添加量对水解度的影响

酶添加量对水解度的影响见图4。

图4 酶添加量对水解度的影响Fig.4 Effect of enzyme addition on degree of hydrolysis

由图4可知,当碱性蛋白酶的添加量在4 000 U/g到8 000 U/g时，大豆豆渣蛋白质的水解度呈现较快的上升趋势；酶添加量超过8 000 U/g后，豆渣蛋白质的水解度基本不再上升。原因可能是碱性蛋白酶的浓度达到一定程度之后，过高的酶添加量使酶分子和底物中的蛋白质分子的碰撞机会减少，从而反应速度降低[32]。所以碱性蛋白酶水解大豆豆渣较适的添加量为8 000 U/g。

2.3 响应面结果分析

以蛋白质水解物的水解度作为响应值（y），进行响应面分析试验。响应面设计方案及结果见表2。

表2 响应面的设计及结果Table 2 Response surface design and results

对模型进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析结果Table 3 Results of ANOVA

续表3 方差分析结果Continue table 3 Results of ANOVA

由表3可知，模型中的P值远小于0.01，模型极显著，模型的失拟项不显著，说明模型选择合适。比较F值大小可知，各因素对水解度的影响大小依次为水解温度＞水解时间＞酶添加量＞pH值。

响应面图见图5～图8。

图5 水解时间与pH值对水解度的影响作用Fig.5 Effects of hydrolysis time and pH on degree of

图6 水解温度与pH值对水解度的影响作用Fig.6 Effects of hydrolysis temperature and pH on degree of hydrolysis

图7 酶添加量与pH值对水解度的影响作用Fig.7 Effect of enzyme activity and pH on degree of hydrolysis

图8 水解温度与水解时间对水解度的影响作用Fig.8 Effect of temperature and time on degree of hydrolysis

等高线是响应面中水平方向的投影，如果一个响应曲面坡度相对较平坦，表明其可以接受自变量的因素的变化，而不影响到响应值大小，相反，如果一个响应曲面坡度非常陡，表明响应值对于自变量因素的变化非常敏锐[33]。由图5～图8的响应面两因素的交互作用以及方差结果分析得出一次项 X1、X2、X3、X4极显著；二次项 X12、X22、X32、X42极显著；交互项 X1X2、X2X3、X2X4、X3X4、X1X4极显著。

综上所述，各因素对于蛋白质水解度影响的程度顺序为水解温度＞水解时间＞酶添加量＞pH值。运用回归方程对豆渣蛋白质的水解工艺条件进行优化，预测最佳水解工艺条件为pH9.23、水解时间3.05 h、酶添加量8 108.11 U/g、水解温度53.21℃。在此条件下，豆渣蛋白质水解度理论值为91.47%。根据实际情况，对工艺条件进行调整，调整后的最佳水解条件为pH9.25、水解时间3.05 h、酶添加量8 108 U/g、水解温度53℃。在此条件重复验证试验3次，得到水解度平均值为91.23%，与理论值基本一致。

2.4 抗氧化性分析

水解肽浓度对DPPH自由基清除率的影响见图9。

图9 水解肽浓度对DPPH自由基清除率的影响Fig.9 Effects of concentrations of hydrolyzed peptides on DPPH radical scavenging rate

由图9可知，豆渣蛋白水解肽的抗氧化性随水解肽浓度的增加呈先上升后下降的趋势，浓度在6%时DPPH自由基清除率达到最大，继续提高水解肽浓度，DPPH自由基清除率不再提高。因此清除DPPH自由基的最佳浓度为6%，清除率达到71.32%。此结论与何晓兰等[34]对于苦荞抗氧化肽的研究的结果类似。

3 结论

本研究采用无污染且高效率的碱性蛋白酶水解方法，通过单因素试验确定响应面的自变量为酶添加量、pH值、水解温度、水解时间，因变量为水解度。试验表明最优水解条件为pH9.25、水解时间3.05 h、酶添加量8 108 U/g、水解温度53℃，水解度达到91.23%。在最优水解条件下得到的豆渣蛋白水解肽进行抗氧化试验，水解肽浓度为6%时DPPH自由基的清除率最大，达到71.32%。