槲皮素对病毒性脑炎幼鼠症状的缓解及对TLR9通路的调节作用研究

闫宇娇，王德莉，石对先

（河南中医药大学第五临床医学院/郑州人民医院，郑州 450000）

病毒性脑炎（viral encephalitis，VE）是一种常见于儿科的感染性中枢神经系统急症[1]。该病因病毒种类以及侵犯部位的不同，临床表现呈多样化，主要为头痛、呕吐、抽搐、发热、运动功能障碍、意识模糊等[2]。目前临床对病毒性脑炎尚无有效的治疗方法，通常采取控制发热、炎症，降低免疫反应损伤，防止呼吸衰竭等措施，但效果并不理想，且其临床特征不明显，易被误诊延误治疗，以致预后不佳，致残率、病死率居高不下[3]。因此，探寻疗效更加确切的病毒性脑炎治疗方式，对于改善病毒性脑炎预后意义重大。槲皮素是慢性支气管炎常用药物，也可用于冠心病、高血压的辅助治疗，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、免疫抑制、抗病毒等功效[4]。本研究通过建立病毒性脑炎幼鼠模型，研究槲皮素对病毒性脑炎的治疗作用，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级雄性BALB/c幼鼠50只，3周龄，体质量（9.45±0.45）g，购自上海茂生衍生物科技有限公司，生产许可SCXK（沪）2017-0004。槲皮素（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司），柯萨奇病毒B3悬液（武汉博威德生物技术有限公司），Toll样受体（toll-like receptor，TLR）9/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）信号通路激动剂CpG寡脱氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN）（上海易汇生物科技有限公司），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、钙结合蛋白（S100 calciumbinding protein B，S-100B）酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），兔抗小鼠TLR9、MyD88、核转录因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）、p-NF-κB蛋白一抗（美国R&D公司）。CX23光学显微镜（日本奥林巴斯株式会社），iMark酶标仪、Gel Doc XR凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），TY-80电泳仪（南京普阳科学仪器研究所）。

1.2 建立病毒性脑炎模型[5]从50只BALB/c幼鼠中随机抽取10只作为对照组，其余建立病毒性脑炎模型。乙醚麻醉后，在右侧眼角与耳根连线中点进针2～3 mm，颅内注射30 μL 100 TCID50 10-3病毒浓度，对照组同位置注射同体积生理盐水。将建模幼鼠随机分为模型组（13只）、槲皮素组（13只）、槲皮素加激动剂组（14只）。实验结束后观察脑组织病理变化，以出现明显病理改变为建模成功。剔除建模失败幼鼠数据及实验过程中死亡幼鼠数据，模型组、槲皮素组建模失败2只，死亡1只，槲皮素加激动剂组建模失败2只，死亡2只，最终各组均纳入10只。

1.3 干预[6-7]建模完成后，槲皮素组灌胃槲皮素生理盐水溶液1 mL（含药量100 mg/kg），腹腔注射生理盐水0.6 μg/g，槲皮素加激动剂组灌胃槲皮素生理盐水溶液1 mL（含药量100 mg/kg）后腹腔注射CpG ODN 0.6 μg/g，对照组、模型组灌胃等体积生理盐水，腹腔注射生理盐水0.6 μg/g。每天1次，持续7 d。

1.4 组织取材 末次干预后，各组幼鼠禁食禁水6 h，腹腔注射戊巴比妥钠深度麻醉，抽取腹主动脉血注入离心管内，3 000 r/min离心15 min，取其上清，置于液氮中保存，后脱颈处死幼鼠，摘取脑组织，分成3份，1份用4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，经病理切片机制作为厚度4 μm连续切片用于HE染色；两份置于液氮中保存用于ELISA实验及蛋白检测。

1.5 检测脑组织炎症指标TNF-α、IL-1β水平 取液氮保存的脑组织，剪碎后加入PBS 1 mL，注入预冷玻璃匀浆器中，充分研磨，4 ℃ 10 000 r/min离心15 min（离心半径8 cm），取其上清，采用ELISA法检测脑组织中TNF-α、IL-1β水平，按照ELISA试剂盒说明书要求设计实验步骤，经酶标仪测定波长570 nm位置吸光度值，通过标准曲线计算TNF-α、IL-1β浓度。

1.6 检测血清神经功能指标IFN-γ、S-100B水平 取液氮保存的主动脉血清，采用ELISA法检测血清中IFN-γ、S-100B水平，按照ELISA试剂盒说明书要求设计实验步骤，经酶标仪测定波长570 nm位置吸光度值，通过标准曲线计算IFN-γ、S-100B浓度。

1.7 HE染色观察脑组织病理学改变 取脑组织切片常规脱蜡，自来水冲洗，加入苏木精液染色，自来水冲洗，盐酸乙醇冲洗3 s，自来水冲洗，加入Scott蓝化液反蓝，自来水冲洗，伊红液染色，梯度乙醇脱水、透明，滴入中性树胶封片，光镜下观察脑组织病理学变化，并拍照记录。

1.8 Western blot法检测脑组织TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达 取液氮保存的脑组织研磨器研磨，加入PBS洗涤匀浆，置于离心管中，注入RIPA裂解液裂解，8 500 r/min离心15 min（离心半径8 cm），经BCA试剂盒定量蛋白。取40 μg样品与上样缓冲液1:5体积比混合，沸水浴5 min，离心取其上清，恒压80 V行上样电泳分离，改110 V湿法转膜，5%脱脂牛奶常温封闭2 h，TBST洗膜，加入兔抗小鼠TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗（1:500），4 ℃摇床孵育2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（1:2 000），常温孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL发光液显色，暗室曝光，经凝胶成像系统扫描拍照，分析灰度值，以TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相对表达量。计算p-NF-κB p65/NF-κB p65。

1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0对数据进行分析与处理，采用均数±标准差（x±s）描述计量资料，采用单因素方差分析比较多样本计量资料，以LSD-t检验比较两两样本。

2 结果

2.1 行为学观察 对照组幼鼠未见行为学异常；建模后幼鼠接种病毒后陆续出现活动量减少、蜷缩、毛发松散、食欲减轻等表现，3 d后出现肢体麻痹、抽搐、耳廓尾部坏死等表现，4只幼鼠死亡，槲皮素组、槲皮素加激动剂组干预后上述症状均有所改善。

2.2 炎症指标水平 与对照组比较，模型组脑组织TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，槲皮素组脑组织TNF-α、IL-1β水平降低（P＜0.05）；与槲皮素组比较，槲皮素加激动剂组脑组织TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组幼鼠脑组织炎症指标水平比较（，n =10）ng/mL

表1 各组幼鼠脑组织炎症指标水平比较（，n =10）ng/mL

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与槲皮素组比较，▲P＜0.05

2.3 神经功能指标IFN-γ、S-100B水平 与对照组比较，模型组血清IFN-γ、S-100B水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，槲皮素组血清IFN-γ、S-100B水平降低（P＜0.05）；与槲皮素组比较，槲皮素加激动剂组血清IFN-γ、S-100B水平升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组幼鼠脑组织神经功能指标水平比较（，n =10）

表2 各组幼鼠脑组织神经功能指标水平比较（，n =10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与槲皮素组比较，▲P＜0.05

2.4 HE染色观察脑组织病理学改变 HE染色结果显示，对照组幼鼠脑组织神经元结构正常；模型组幼鼠脑组织明显水肿，大量神经细胞坏死，神经元树突消失、细胞核染色重，炎性细胞大量浸润；槲皮素组、槲皮素加激动剂组幼鼠脑组织水肿程度减轻，神经元少量变性，炎性细胞少量浸润，槲皮素组病理改善程度更为明显。见图1。

图1 HE染色观察各组脑组织病理变化（×400，标尺25 μm）

2.5 脑组织TLR9、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65 与对照组比较，模型组脑组织TLR9、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高（P＜0.05）；与模型组比较，槲皮素组脑组织TLR9、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65降低（P＜0.05）；与槲皮素组比较，槲皮素加激动剂组脑组织TLR9、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高（P＜0.05）。见图2，表3。

图2 Western blot法检测脑组织TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达

表3 各组脑组织TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达（，n =10）

表3 各组脑组织TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达（，n =10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与槲皮素组比较，▲P＜0.05

3 讨论

病毒性脑炎是由于脑实质被各种病毒侵犯而引发的急性炎症疾病，其病情与患者的免疫状态关系密切，智力降低、瘫痪、癫痫等预后不良后遗症频发[8]。疱疹病毒、小肠病毒、日本脑炎病毒、巨细胞病毒均是病毒性脑炎的常见病原体，我国流行病调查研究显示，小肠病毒是病毒性脑炎最常见的病因[9]。目前病毒性脑炎发病机制尚不明确，通常认为与灰质炎症反应及免疫介导损伤有关[10]。尽管西药可在一定程度上保护病毒性脑炎脑损伤，但由于药物自身疗效的局限性及不良反应，临床应用受到一定限制。随着对祖国医学研究的逐步深入，相对安全的中药及其单体成分逐渐应用于病毒性脑炎治疗中。

IFN-γ是辅助T1样细胞、自然杀伤细胞活化后产生的单糖蛋白，可间接活化巨噬细胞、中性粒细胞，增强其吞噬能力及抗病毒能力，是机体重要免疫调控因子，常用来作为神经功能损伤标记物[11]。S-100B是脑组织胶质细胞分泌的高度保守的钙结合蛋白，在机体中枢神经系统中广泛分布，其会在脑组织损伤时溢出，进入脑脊液及血液中，是判断脑损伤程度的特异性指标之一[12]。槲皮素是提取自壳斗科、小檗科、金丝桃科植物皮叶的黄酮醇类化合物，在植物界广泛分布，是一种天然抗氧化剂，国外常被用于治疗前列腺癌[13]。有研究表明[14]，槲皮素通过抑制小胶质细胞衍生的氧化应激反应和炎症反应，有效减轻小鼠脑梗塞体积及认知、运动功能缺陷，提示其对脑损伤的治疗作用。本研究结果显示，与模型组比较，槲皮素组脑组织TNF-α、IL-1β水平、血清IFN-γ、S-100B水平降低，HE染色结果显示，与模型组比较，槲皮素组脑组织水肿程度减轻，神经元变性、炎性细胞浸润减少，提示槲皮素可降低脑组织炎症反应，减轻神经功能损伤及脑组织病理学变化。

TLR9/MyD88信号通路是机体经典炎症反应通路。TLR9是模式识别受体蛋白，广泛分布于多种细胞膜及细胞内，参与介导机体先天及特异性免疫[15]。MyD88是其下游转接蛋白，TLR9与相关损伤因子配体结合后，激活MyD88蛋白，通过信号传导刺激NF-κB，其磷酸化后转移至细胞核，诱导巨噬细胞、单核细胞合成并释放TNF-α、IL-1β等炎症因子，促进炎症反应发生[16]。Zhou等[17]研究认为，抑制TLR9信号通路可下调脑组织炎症因子IL-1β、TNF-α水平，对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。本研究结果显示，与对照组比较，模型组脑组织TLR9、MyD88蛋白表达量、p-NF-κB p65/NF-κB p65升高，经槲皮素干预后均降低，且在槲皮素基础上增用TLR9/MyD88信号通路激动剂CpG ODN可减弱槲皮素对病毒性脑炎的治疗作用，提示TLR9/MyD88信号通路在病毒性脑炎中异常激活，槲皮素可能通过抑制该通路对病毒性脑炎幼鼠产生治疗作用。

综上所述，槲皮素可缓解病毒性脑炎幼鼠症状，减轻炎症反应及神经功能损伤，推测其作用机制与抑制TLR9/MyD88信号通路有关。