疏肝解郁汤对大鼠急性乳腺炎的抑制效果与机制研究

马晓佳，杨璐妍，黄冬涵，李本发，黄 敏

（1.云南省中医医院/云南中医药大学第一附属医院，昆明 650000；2云南中医药大学，昆明 650000）

乳腺炎属于乳房化脓性炎症，是一种最常见的乳腺疾病，主要特征为乳腺水肿，组织内皮和上皮完整性破坏，多发生于女性产后哺乳期，由病原微生物感染所致[1-2]。MAP激酶（MAPK）信号通路与p38蛋白在炎症反应的调控中发挥着关键作用[3-5]。有研究报道磷酸化p38蛋白参与了金黄色葡萄球菌诱导小鼠乳腺炎和肺炎的形成[6]。因为临床上乳腺炎多由细菌感染引起，所以抗生素治疗成为了治疗急性乳腺炎的主要方法[7]。但长期广泛使用抗生素会导致病原菌产生耐药，也易导致炎症组织机化遗留冷性僵块，迁延难愈，逐渐成为制约乳腺炎治疗的瓶颈。

中医将急性乳腺炎归属于“乳痈”范畴，在用药治疗方面积累了丰富的经验[8]，多治以清热解毒、通乳散结，具有疗效好，不良反应少等优点[9]，记载于《医宗金鉴》的瓜蒌牛蒡汤属于治疗乳痈经典名方，具有清热散邪、疏肝解郁等作用，多用于早期乳痈[10-11]。疏肝解郁汤在瓜蒌牛篣汤的基础上进行重新组方，既加强了疏肝清胃通乳的功效，又避免了原方过于寒凉，易形成冷性僵块的弊端。本科室使用疏肝解郁汤数年，临床疗效显著，患者获益颇丰，但详细机制不明，因此本研究从“疏肝解郁”方面探究重组方剂对乳腺炎的治疗效果及其机制，为治疗乳腺炎的提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 清洁级SD雌性孕期大鼠，8～10周龄，体质量200～220 g，购自成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（川）2020-030，使用许可证号：SYXK（川）2019-189。疏肝解郁汤方剂组成：全瓜蒌15 g，炒柴胡10 g，牛蒡子15 g，重楼10 g，蒲公英15 g，制香附10 g，炒青皮10 g，郁金10 g，陈皮10 g，玫瑰花5 g，丝瓜络10 g，鹿角霜10 g。将药物在清水中浸泡0.5～1 h，煎取2次，第一次为0.5 h，第二次为0.3 h，混合两次药液，浓缩过滤至1 g/mL，冷藏备用，由云南中医药大学第一附属医院药剂科提供，给药时使用生理盐水进行稀释。大鼠IL-1、IL-6、TNF-α免疫酶联试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司。p38、p-p38、β-actin抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司。MAPKAPK2、p-MAPKAPK2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。SpectraMAX Plus384酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；STM7显微镜（日本Olympus公司）；多功能凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；JY-SCZ4+垂直电泳槽、JY200C电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；5200化学发光凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要实验方法

1.2.1 LPS大鼠乳腺炎模型构建及药物干预[12]大鼠分娩后泌乳第5～7天，随机分为空白组、模型组、疏肝解郁中药汤剂低剂量组（2.5 mg/kg）、疏肝解郁中药汤剂中剂量组（5 mg/kg）、疏肝解郁中药汤剂高剂量组（10 mg/kg），每组10只。与幼鼠隔离1 h后，将疏肝解郁中药汤剂分别稀释为0.125、0.25、0.5 mg/mL，给药容积为20 mL/kg，进行灌胃，空白组和模型组灌胃生理盐水，每天1次，持续5 d。末次灌胃1 h后腹腔注射戊巴比妥钠（0.6 g/kg）进行麻醉，取仰卧位置于体视显微镜下，乙醇消毒第4对乳头并使其充分暴露，镊子固定乳头，用眼科剪剪去乳头尖端处，暴露乳导管，然后用微量注射器缓慢插入乳导管并灌注LPS（0.2 mg/mL），空白组灌注生理盐水，停留数秒后再缓慢抽出针头。12 h后各剂量组再次灌胃疏肝解郁汤，空白组和模型组灌胃相同剂量的生理盐水。LPS刺激24 h后腹腔注射戊巴比妥钠（0.6 g/kg）麻醉后进行颈椎脱臼处死大鼠，采集指标供后续测定。

1.2.2 乳腺组织病理学检测 乙醇消毒后使用解剖剪剪开大鼠腹部皮肤，使第4对乳腺组织充分暴露，剥离乳腺组织放置在4%多聚甲醛中固定过夜，各组标本进行脱水处理后制作石蜡切片，HE染色后使用显微镜在100、400倍放大倍数下观察乳腺组织病理学变化。

1.2.3 Elisa 检测收集各组动物血液与乳腺组织，血液经离心后收集上层血清。乳腺组织制成10%组织匀浆液，离心后收集上清液，按Elisa试剂盒说明书分别测定血清与组织中IL-1、IL-6与TNF-α的含量。

1.2.4 Western Blot 收集各组乳腺组织，加入组织裂解液在冰上进行蛋白质提取，同时进行蛋白定量。定量后加入Loading Buffer后97 ℃水浴10 min进行蛋白变性，在4 ℃下保存备用。按30 μg蛋白进行凝胶电泳，转移至PVDF膜上，转膜后在5%脱脂奶粉中室温封闭2 h，转移至一抗中4 ℃过夜孵育，TBST清洗3遍后室温孵育二抗2 h，TBST清洗3遍后进行ECL化学发光，在凝胶成像系统中观察条带，并进行拍照与灰度值分析，以β-actin作为内参，计算蛋白表达水平。

1.3 统计学分析 使用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。所有数值均采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较使用单因素方差分析，进一步两两比较使用LSD-t检验。

2 结果

2.1 疏肝解郁汤对乳腺炎大鼠乳腺组织影响 观察发现，空白组大鼠乳腺组织中乳腺小叶结构较为明显，周围腺泡数量较多，无明显坏死或炎细胞浸润；模型组大鼠乳腺组织导管部分上皮细胞坏死脱落于管腔内，部分细胞崩解，胞核固缩、碎裂或溶解消失，管腔内可见杆状核中性粒细胞等炎细胞浸润；疏肝解郁汤低剂量组大鼠活动期乳腺组织乳腺小叶结构清晰，叶间间隙小，周围腺泡数量较多，导管少量上皮细胞坏死，胞核溶解，管腔内可见少量炎细胞浸润，少量腺泡上皮细胞坏死；疏肝解郁汤中剂量组大鼠活动期乳腺组织乳腺小叶结构清晰，叶间间隙小，周围腺泡数量较多；导管少量上皮细胞空泡变性，管腔可见少量的淋巴细胞浸润，部分腺泡上皮细胞空泡变性，腺泡腔内少量的淋巴细胞浸润；疏肝解郁汤高剂量组大鼠活动期乳腺组织乳腺小叶结构清晰，周围腺泡数量较多，导管结构完整，无明显坏死及炎细胞浸润；少量腺泡上皮细胞空泡变性。具体见图1。

图1 各组大鼠乳腺组织变化情况（HE染色，放大倍数100、400倍）

2.2 疏肝解郁汤对乳腺炎大鼠血清与乳腺组织中IL-1、IL-6、TNF-α的影响 结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清与组织中IL-1、IL-6、TNF-α的含量均升高（P＜0.01）；与模型组相比，疏肝解郁汤高剂量组血清与组织中IL-1、IL-6、TNF-α的含量均降低（P＜0.05），疏肝解郁汤中剂量组血清与组织中IL-1、组织中IL-6含量降低（P＜0.05），疏肝解郁汤低剂量组虽有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），具体结果见表1、表2。

表1 各组动物血清中IL-1、IL-6、TNF-α变化情况（，n =10） pg/mL

表1 各组动物血清中IL-1、IL-6、TNF-α变化情况（，n =10） pg/mL

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

表2 各组动物乳腺组织中IL-1、IL-6、TNF-α变化情况（，n =10） pg/mL

表2 各组动物乳腺组织中IL-1、IL-6、TNF-α变化情况（，n =10） pg/mL

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.3 疏肝解郁汤对乳腺炎大鼠乳腺组织中p38、p-p38、MAPKAPK2与p-MAPKAPK2蛋白表达的影响 与空白组相比，各组大鼠乳腺组织中p38与MAPKAPK2蛋白表达水平无变化（P＞0.05），其中模型组p-p38与p-MAPKAPK2蛋白表达水平升高（P＜0.01）；与模型组相比，疏肝解郁汤高、中、低剂量组p-p38蛋白表达水平降低（P＜0.01），高剂量组p-MAPKAPK2蛋白水平下降（P＜0.05），中、低剂量组p-MAPKAPK2无明显变化（P＞0.05），具体见图2。

图2 各组大鼠乳腺组织蛋白表达水平变化情况

3 讨论

LPS能诱导机体产生急性炎症反应，因此被用于构建多种动物乳腺炎模型中[13-15]。本实验通过病理学观察发现模型组乳腺组织中存在大量中性粒细胞等炎性细胞聚集的情况，符合乳腺炎的症状[16-17]，说明动物乳腺炎模型构建成功。而使用疏肝解郁汤后，乳腺组织中腺泡数量与导管结构开始恢复，中性粒细胞与淋巴细胞消失，说明疏肝解郁汤具有缓解乳腺组织病变效果。

IL-1是一种炎症介质，具有IL-1α与IL-1β两种亚型[18]。IL-1β被外来抗原刺激后分泌量急剧增加；IL-6是一种多功能细胞因子，参与免疫反应与急性期炎症反应[19]；TNF-α是TNF家族的促炎症成员，在组织损伤、内毒素刺激和感染时产生[20-22]。已有研究证实，减少促炎细胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α的产生可以降低乳腺炎的影响[23]。本实验使用疏肝解郁汤后，组织与血清的炎症因子含量降低，结合病理学观察发现组织的炎症症状开始消失，乳腺炎得到好转，高剂量效果最好，由此说明疏肝解郁汤可能通过减少炎症因子产生起到抗炎效果。

MAPK信号通路广泛参与机体的炎症和应激反应，并提供关键的抗炎药物靶点[24]。MAPKAPK2是MAPK通路的下游表达产物，参与调控炎症因子如TNF-α、IL-6、IL-1β的表达，主要由p38调控激活[25]。本研究发现，LPS诱导的乳腺炎可以促进p38与MAPKAPK2蛋白的磷酸化激活，使炎症因子的分泌增多（P＜0.05）；给药后p38与MAPKAPK2蛋白磷酸化水平降低（P＜0.05），说明疏肝解郁汤可能通过抑制p38/MAPKAPK2通路产生抗炎的作用。

本方对瓜蒌牛蒡汤进行重新组方并添加了重楼，现代药理研究表明，重楼皂苷具有消炎、镇痛、止血、抗感染的效果[26]，加味后疏肝清胃通乳的功效更上一层楼。炒青皮、制香附、郁金、玫瑰花有疏肝理气的效果，丝瓜络有通乳消痈的疗效，陈皮和胃散结，鹿角霜运用其中，防止寒凉过重使肿块难消，形成冷性僵块。数药合用共奏疏肝解郁，清热消痈之效。

综上所述，疏肝解郁汤具有抗炎消痈的效果，能减少LPS诱导的大鼠乳腺炎乳腺组织的炎症反应，降低血清与组织中的炎症因子，作用机制可能是抑制p38/MAPKAPK2通路。