盐酸石蒜碱通过调控circSEPT9/miR-654-5p影响结直肠癌SW620细胞增殖及凋亡的机制*

2022-02-28周晓华

华中科技大学学报（医学版） 2022年1期

周晓华,李合

海南医学院第一附属医院普通外科,海口 570102

结直肠癌是我国常见的一种消化系统恶性肿瘤,具有恶性程度高、易转移等特点。研究表明从植物中提取的某些活性成分可调控细胞生物学行为,达到抗结直肠癌的作用[1-4]。盐酸石蒜碱(lycorine hydrochloride,LH)是从石蒜科植物中提取的一种异喹啉类生物碱,研究表明盐酸石蒜碱可抑制胆管癌细胞的增殖[5],但盐酸石蒜碱与结直肠癌相关研究报道相对较少。环状RNA(circular RNA,circ RNA)是一种缺少5′和3′末端的共价闭合环状转录本,其在肿瘤中异常表达,且可能与肿瘤发生及发展过程相关。研究表明circSEPT9在三阴性乳腺癌组织中的表达比正常组织增加,对其表达进行抑制,在一定程度上对三阴性乳腺癌细胞的发生和发展具有一定抑制作用[6]。StarBase预测显示circ-SEPT9与miR-654-5p存在结合位点。研究表明miR-654-5p在结直肠癌细胞中低表达,过表达miR-654-5p可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[7]。但circSEPT9与miR-654-5p的靶向关系尚未验证。因此,本研究主要探讨盐酸石蒜碱是否可通过circSEPT9/miR-654-5p通路影响结直肠癌细胞的增殖和凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸石蒜碱购自上海麦克林生化科技有限公司;人结直肠癌细胞SW620购自上海麒盟生物医学有限公司;DMEM培养液、胎牛血清、MTT试剂、细胞凋亡检测试剂购自上海碧云天生物;RNA提取试剂购自北京全式金生物公司;反转录试剂与SYBR Green试剂购自北京天根生化公司;Lipofectamine2000、pc DNA-circSEPT9、pcDNA购自美国Invitrogen公司;miR-NC、miR-654-5p mimics、si-NC、si-circSEPT9、anti-miR-654-5p购自广州锐博生物公司;荧光素酶报告基因载体WT-circ-SEPT9、MUT-circSEPT9购自美国Promega公司;荧光素酶活性检测试剂购自北京索莱宝公司;兔抗人cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9单克隆抗体与二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.2 实验处理及分组

将SW620细胞放置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,将其放置温度为37℃、CO2浓度为5%条件下培养,并使用0.25%胰蛋白酶消化,待细胞生长至80%融合度时,0.25%胰蛋白酶消化。终止消化后,进行传代培养,培养后细胞稳定传代3～5代后取出等待实验。随后将SW620细胞于对数生长期内接种于6孔板,选取的接种密度为2×104个/孔,加入不同浓度(1.2、2.4、4.8μmol/L)盐酸石蒜碱处理24 h[8],分别记为LH-L组、LH-M组、LH-H组。所有步骤均按照说明书进行,采取脂质体转染法,将si-NC、si-circSEPT9分别转染至SW620细胞,分别记为si-NC组、si-circSEPT9组。将pcDNA-circSEPT9、anti-miR-654-5p分别转染至SW620细胞,转染成功后加入4.8μmol/L盐酸石蒜碱处理24 h,分别记为LH+pcDNA-circSEPT9组、LH+anti-miR-654-5p组。

1.3 MTT检测细胞增殖

收集各组SW620细胞,按照每孔3000个接种于96孔板,将其置于培养箱内孵育24 h,随后在每个孔内加入20μL MTT溶液,将其置于培养箱内孵育,4 h后将上清液去除,并在每个孔内加入150 μL二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO),放置室温阴暗处,5 min后使用酶标仪对其吸光度值(A)进行测定,细胞增殖抑制率=(对照组A值-实验组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%

1.4 平板克隆形成实验

将各组SW620细胞按照每孔500个细胞接种于6孔板,并将其置于培养箱内,培养2周后换液,更换的频率为每2天1次。将PBS进行预冷操作,操作完成后将细胞进行洗涤,在每个孔内均加入甲醇溶液,含量为500μL,在-20℃的条件下将其固定,20 min后将甲醇溶液清除,并将每个孔加入结晶紫染色液,含量为400μL,浓度为1%的染色液,每孔染色15 min后用清水将细胞进行洗涤并晾干,观察其集落形成数(≥30个细胞),统计细胞克隆形成数。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率

以预冷PBS对各组SW620细胞进行洗涤,3000 r/min离心6 min后将上清去除,加入缓冲液500μL使其结合,加入5μL AnnexinⅤ-FITC与PI,将其放置室温下孵育,10 min后对细胞凋亡率进行检测。

1.6 qRT-PCR检测circSEPT9、miR-654-5p表达

首先将Trizol注入各组细胞中,对SW620细胞总RNA进行提取,RNA提取完成后,首先对RNA的浓度和纯度给予检测,使用的方法为Nanodrop2000c超微量法,随后使用反转录试剂盒将其反转录成cDNA,PCR荧光试剂盒检测,每个样品设3个重复,反应条件为95℃5 min,95℃和60℃下各30 s、72℃30 s,共循环40次,并将60℃的温度下时间延长至5 min。分别以GAPDH和U6为circSEPT9、miR-654-5p的内参,使用2-ΔΔCt法对其表达水平进行定量。

1.7 双荧光素酶实验检测circSEPT9与miR-654-5p靶向关系

Star Base预测circSEPT9与miR-654-5p存在结合位点,对结合位点通过基因突变技术将其进行变更,从而将野生型载体和突变型载体均给予构建。用脂质体转染法将miR-NC/WT-circSEPT9、miRNC/MUT-circSEPT9、miR-654-5p mimics/WT-circSEPT9、miR-654-5p mimics/MUT-circSEPT9分别转染至SW620细胞,24 h后收集细胞,并利用双荧光素法对其进行处理,并对其所具活性进行检测。

1.8 Western blot检测cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白

收集各组SW620细胞后加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白,按照每孔30μg蛋白样品上样进行电泳反应(12%SDS-PAGE),电泳反应条件:80 V 30 min、120 V 90 min,转膜后将其置于含有5%脱脂牛奶封闭液中,对其完全封闭2 h,加入cleaved Caspase-3(1∶800)、cleaved Caspase-9(1∶800)一抗与内参GAPDH抗体(1∶1000)稀释液在4℃孵育24 h,加入二抗(1∶3000)稀释液在37℃孵育2 h,室温洗涤,均匀滴加ECL发光试剂,暗室内曝光显影,应用Image J软件分析灰度值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 盐酸石蒜碱对结直肠癌SW620细胞增殖的影响

与对照(Con)组比较,LH-L组、LH-M组、LH-H组细胞增殖抑制率升高(均P＜0.05),细胞克隆形成数减少(均P＜0.05),且呈剂量依赖性,见表1。

表1 盐酸石蒜碱对结直肠癌SW620细胞增殖的影响(±s,n=9)Table 1 The effect of lycorine hydrochloride on the proliferation of colorectal cancer SW620 cells(±s,n=9)

与Con组比较,*P＜0.05;与LH-L组比较,#P＜0.05;与LHM组比较,△P＜0.05

分组抑制率(%) 细胞克隆形成数(个)Con 0.00±0.00 118.96±10.74 LH-L 23.21±2.18* 90.71±7.49*LH-M 46.01±4.22*# 73.04±5.69*#LH-H 64.82±5.45*#△ 52.26±4.37*#△

2.2 盐酸石蒜碱对结直肠癌SW620细胞凋亡的影响

与Con组比较,LH-L组、LH-M组、LH-H组细胞凋亡率和cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白水平升高(均P＜0.05),且呈剂量依赖性,见图1、表2。

图1 盐酸石蒜碱对结直肠癌SW620细胞凋亡的影响Fig.1 The effect of lycorine hydrochloride on colorectal cancer SW620 cell apoptosis

表2 盐酸石蒜碱对结直肠癌SW620细胞凋亡的影响(±s,n=9)Table 2 The effect of lycorine hydrochloride on colorectal cancer SW620 cell apoptosis(±s,n=9)

与Con组比较,*P＜0.05;与LH-L组比较,#P＜0.05;与LH-M组比较,△P＜0.05

分组凋亡率(%) cleaved Caspase-3蛋白 cleaved Caspase-9蛋白Con 6.11±0.49 0.18±0.02 0.23±0.02 LH-L 11.03±0.87* 0.31±0.03* 0.37±0.03*LH-M 16.99±1.21*# 0.43±0.04*# 0.52±0.04*#LH-H 23.22±2.22*#△ 0.58±0.04*#△ 0.68±0.05*#△

2.3 盐酸石蒜碱对结直肠癌SW620细胞circSEPT9和miR-654-5p表达的影响

与Con组比较,LH-L组、LH-M组、LH-H组circSEPT9的表达量降低(均P＜0.05),miR-654-5p的表达量升高(均P＜0.05),且呈剂量依赖性,见表3。

表3 盐酸石蒜碱对结直肠癌SW620细胞circSEPT9和miR-654-5p表达的影响(±s,n=9)Table 3 The effect of lycorine hydrochloride on the expression of circSEPT9 and miR-654-5p in colorectal cancer SW620 cells(±s,n=9)

与Con组比较,*P＜0.05;与LH-L组比较,#P＜0.05;与LHM组比较,△P＜0.05

分组 circSEPT9 miR-654-5p Con 1.00±0.00 1.00±0.00 LH-L 0.81±0.06* 1.58±0.17*LH-M 0.63±0.05*# 2.26±0.23*#LH-H 0.47±0.04*#△ 3.32±0.27*#△

2.4 circSEPT9靶向调控miR-654-5p表达

Star Base预测结果见图2,二者之间存在结合位点。共转染WT-circSEPT9的细胞实验中,miR-654-5p组(0.35±0.03)相对荧光素酶活性显著低于miR-NC组(0.99±0.07)(t=25.211,P＜0.05);共转染MUT-circSEPT9的细胞实验中,miR-654-5p组(1.00±0.05)相对荧光素酶活性与miR-NC组(0.97±0.06)比较差异无统计学意义(t=1.152,P=0.266)。pc DNA-circSEPT9组(1.00±0.00)miR-654-5p表达显著高于pcDNA组(0.46±0.04);si-circSEPT9组(1.01±0.07)miR-654-5p表达量显著低于si-NC组(2.96±0.22)(F=791.710,P＜0.05)。

图2 circSEPT9序列中包含核苷酸序列与miR-654-5p互补Fig.2 The nucleotide sequence within the circSEPT9 sequence was complementary to miR-654-5p

2.5 干扰circSEPT9表达对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响

与si-NC组比较,si-circSEPT9组miR-654-5p的表达量升高(均P＜0.05),细胞增殖抑制率升高(P＜0.05),细胞克隆形成数减少(P＜0.05),细胞凋亡率和cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白水平升高(均P＜0.05),见图3、表4。

图3 干扰circSEPT9表达对结直肠癌SW620细胞凋亡的影响Fig.3 The effect of interference with circSEPT9 expression on the apoptosis of colorectal cancer SW620 cells

表4 干扰circSEPT9表达对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响(x¯±s,n=9)Table 4 The effect of interference with circSEPT9 expression on the proliferation and apoptosis of colorectal cancer SW620 cells(x¯±s,n=9)

2.6 circSEPT9过表达或抑制miR-654-5p表达逆转了盐酸石蒜碱(4.8μmol/L)对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用

与LH组比较,LH+pcDNA-circSEPT9组、LH+anti-miR-654-5p组miR-654-5p的表达量降低(均P＜0.05),细胞增殖抑制率降低(均P＜0.05),细胞克隆形成数增多(均P＜0.05),细胞凋亡率和cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白水平降低(均P＜0.05),见图4、表5。

表5 circSEPT9过表达或抑制miR-654-5p表达逆转了盐酸石蒜碱对结直肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用(±s,n=9)Table 5 Overexpression of circSEPT9 or inhibition of miR-654-5p expression reversed the effect of lycorine hydrochloride on the proliferation and apoptosis of colorectal cancer SW620 cells(±s,n=9)

与LH组比较,*P＜0.05

分组 circSEPT9 miR-654-5p增殖抑制率(%)细胞克隆形成数(个)凋亡率(%)cleaved Caspase-3蛋白cleaved Caspase-9蛋白LH 1.00±0.00 1.00±0.00 66.47±4.71 50.27±4.34 25.21±2.21 0.59±0.05 0.69±0.04 LH+pc DNA-circSEPT9 3.26±0.28*0.41±0.04*24.21±2.18*87.26±6.26*13.85±1.28*0.28±0.03*0.35±0.03*LH+anti-miR-654-5p - 0.38±0.03*22.59±2.02*89.78±6.84*10.65±1.02*0.26±0.03*0.30±0.03*

图4 circSEPT9过表达或抑制miR-654-5p表达逆转了盐酸石蒜碱对结直肠癌SW620细胞凋亡的作用Fig.4 Overexpression of circSEPT9 or inhibition of miR-654-5p expression reversed the effect of lycorine hydrochloride on colorectal cancer SW620 cell apoptosis

3 讨论

结直肠癌的发病机制尚未阐明,肿瘤细胞增殖与凋亡异常可促进结直肠癌发展进程,化疗是结直肠癌患者的重要治疗方法,但化疗药物具有毒副作用,机体易产生耐药性从而导致治疗效果不佳,研究表明从植物中提取的活性成分具有抗结直肠癌作用,并可抑制细胞增殖及促进细胞凋亡[9]。circ RNA不受核酸外切酶的影响,具有结构稳定性、组织特异性等特点,并可能用于肿瘤早期诊断及判断患者预后的分子标志物。研究表明circ RNA在结直肠癌发生及发展过程中发挥重要调控作用,还可通过充当miRNA的海绵分子而调节结直肠癌细胞生物学行为[10-11]。但circRNA是否可作为药物治疗结直肠癌的潜在靶点尚需进一步探究。

石蒜碱可抑制肺癌[12]、肾癌[13]细胞增殖及促进细胞凋亡,还可抑制结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭[14]。本研究发现给予不同浓度的盐酸石蒜碱,随着浓度的升高,结直肠癌细胞增殖抑制率升高,细胞克隆形成数减少,提示盐酸石蒜碱可抑制结直肠癌细胞增殖及克隆形成。Caspase级联反应可控制细胞凋亡,其中Caspase-3、Caspase-9被激活后可分别形成cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9,并在细胞的凋亡过程中发挥关键作用[15]。另外,通过给予结直肠癌细胞不同浓度的盐酸石蒜碱处理,癌细胞的细胞凋亡率显著升高,细胞内cleaved Caspase-9蛋白水平升高,且呈剂量依赖性,提示盐酸石蒜碱可促进结直肠癌细胞凋亡。本研究进一步分析显示,盐酸石蒜碱能够以浓度依赖性的方式降低结直肠癌细胞中circSEPT9的表达量,而miR-654-5p的表达量升高,提示盐酸石蒜碱可能通过调节circSEPT9/miR-654-5p表达从而发挥抗结直肠癌的作用。

有研究指出,在胶质瘤组织中,可以发现circ-SEPT9呈现显著高表达,所以若对其进行干扰,或许在一定程度上可以抑制胶质瘤生长,另一方面在细胞的凋亡中起到促进作用[16]。本研究发现circ-SEPT9可靶向结合miR-654-5p。研究表明miR-654-5p可抑制卵巢癌发展[17]。将骨肉瘤组织中miR-654-5p表达上调,在一定程度上可以影响骨肉瘤的发生发展,包括骨肉瘤细胞的迁移、增殖等[18]。miR-654-5p在卵巢癌中呈低表达,上调其表达可抑制卵巢癌细胞增殖及转移[19]。本研究结果显示,干扰circSEPT9表达可促进miR-654-5p表达,并可促使细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高,而减弱细胞克隆形成能力。进一步研究证实circSEPT9过表达或抑制miR-654-5p表达均可逆转盐酸石蒜碱对结直肠癌细胞增殖、克隆形成的抑制作用及其对细胞凋亡的促进作用。提示盐酸石蒜碱通过调控circSEPT9/miR-654-5p而发挥抗结直肠癌的作用。

综上所述,盐酸石蒜碱可抑制结直肠癌细胞生长,促进其凋亡,这一作用与抑制circSEPT9表达及促进miR-654-5p表达有关;circSEPT9与miR-654-5p存在靶向调控作用,circSEPT9/miR-654-5p可能参与结直肠癌发生及发展过程。本研究为进一步阐释结直肠癌的发病机制奠定实验基础。在结直肠癌临床治疗中,可以给予盐酸石蒜碱治疗,而circSEPT9/miR-654-5p可以作为潜在靶点辅助治疗。但关于其机制本研究尚未明确,在今后研究中,可以通过进一步扩大研究范围,将其作用机制进一步探明。