原核持续时间预测胚胎发育潜力的研究

李柔，周静，2，廖宏庆，2*，周俊，2

(1.南华大学附属第二医院，衡阳 421001；2.衡阳南华星辉生殖健康专科医院，衡阳 421001)

自时差成像(time-lapse imaging，TLI)技术广泛应用于胚胎观测后，胚胎学家从中获取了大量的形态动力学信息，为准确评估和选择优质胚胎提供了新方法。如何准确有效地利用动力学参数筛选出优质胚胎，是当前胚胎学家研究的热点。

受精是严格有序的生理过程，是指成熟的精子与次级卵母细胞相互作用并结合成为受精卵。精卵开始融合时，次级卵母细胞被激活，单倍染色体开始向细胞中央移动，核膜形成，雌原核(female pronucleus)显现；同时精子核在进入卵子后，核膜发生崩解，精子核染色质解聚，新形成的原核膜包在染色质外周，形成雄原核(male pronucleus)，雌雄原核形成的时间对应TLI观测下的原核出现时间(time of PN appearance，tPNa)。有学者指出，tPNa与精子染色质的重塑过程息息相关[1]。伴随着雌雄原核的发育，DNA合成和染色质的复制同步进行，随后两原核的核膜消失，染色体互混，该时间点对应了原核消失时间(time of PN fading，tPNf)。研究显示tPNf与胚胎后期的囊胚形成[2]、种植[3]、活产[4]和染色体异常[5]有关。配子转变为胚胎后，细胞周期将重新启动[6]，从减数分裂向有丝分裂过渡。原核持续时间(原核消失时间-原核出现时间，即tPNf-tPNa)包含有丝分裂的分裂间期和分裂期的前期，其中分裂间期会完成DNA分子的复制和相关蛋白质的合成，为胚胎后续的卵裂进行活跃的物质准备。

原核的形态动力学是影响哺乳动物胚胎发生的重要因素[7]。原核持续时间可反映胚胎内遗传物质的准备时长，该参数可否对胚胎发育潜力作出预测，在现有的研究中尚未阐明。本研究对922枚正常受精胚胎的原核持续时间及后期发育情况进行回顾性分析，旨在寻找有助于胚胎选择的新指标。

资料与方法

一、研究对象

收集2018年9月至2021年1月在衡阳南华星辉生殖健康专科医院行TLI系统观测的922枚正常受精胚胎作为研究对象。

纳入标准：新鲜取卵周期；行短时IVF、卵胞浆内单精子注射(ICSI)正常受精来源的胚胎；排除异常受精胚胎。

二、诊疗回顾

1.控制性促排卵、配子采集及人工授精：根据患者情况制定个性化治疗方案，包括激动剂长方案、拮抗剂方案、氯米酚方案以及自然周期取卵等。结合B超及激素水平监测卵泡生长情况，待主导卵泡直径达18～20 mm后采用10 000 U HCG(珠海丽珠制药)扳机，34～36 h后行阴道B超引导下卵泡穿刺取卵术。男方禁欲3～7 d，于取卵当日通过手淫法取精。根据双方病史、精液情况选择短时IVF或ICSI助孕。短时IVF授精时间为HCG扳机后39.5 h，将精子按1.5×106/ml的浓度与卵子共孵育，5 h后进行脱颗粒，并将其转移至TLI系统中。ICSI授精时间为HCG扳机后41 h，将成熟卵母细胞行单精子卵胞浆内显微注射，转移至TLI系统中观察培养。

2.受精评估与胚胎培养：利用时差显微镜观察原核形成情况，若形成2个清晰原核视为正常受精，形成1个或2个以上原核为异常受精，未形成原核考虑为未受精。胚胎培养采用卵裂胚培养液(COOK，美国)和囊胚培养液(COOK，美国)，培养箱环境为6.0%CO2、5.0%O2、37℃。

3.TLI系统及形态动力学参数：本研究所采用的TLI系统是Primo Vision EVO+(Vitrolife，瑞典)，它将培养箱与倒置显微镜结合，通过数据线将胚胎发育过程中采集到的图片传输至培养箱外的电脑中，每间隔10 min对胚胎进行1次拍摄，通过图片信息来收集胚胎发育过程中的动力学参数。此培养系统使用专用16孔微孔培养皿(Vitrolife，瑞典)，每孔存放1枚胚胎，对应不同编号以示区分。每次观测的胚胎数不超过16枚。

动力学参数：tPNa：至少可见1个清晰原核的时间；tPNf：两个原核均消失的时间；原核持续时间：tPNf-tPNa。

4.胚胎评估：D3优质卵裂胚参考Istanbul共识中的优质胚胎标准：受精后第3天胚胎细胞数为7～9个、细胞大小符合发育阶段、碎片程度小于10%、无多核化的胚胎为优质胚胎。囊胚评级按Gardner评分标准，包括囊胚腔大小、内细胞团以及外胚滋养层3个指标，评分≥3BB的囊胚视为优质囊胚。

5.结局指标及定义：优质卵裂胚形成率=优质卵裂胚总数/正常受精胚胎总数×100%；囊胚形成率=总囊胚数(D5+D6)/行囊胚培养胚胎总数×100%；优质囊胚形成率=优质囊胚数(D5+D6)/行囊胚培养胚胎总数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植(鲜胚+冻胚)周期数×100%(为保证统计结果的准确性，仅对单胚胎移植的周期数据进行统计分析)；移植4周后B超检查见宫内孕囊定义为临床妊娠。

三、分组分析

首先根据原核持续时间的长短(以15 h为界)将所有纳入研究的胚胎分为两组：≤15 h组(n=388)和>15 h组(n=534)，比较两组胚胎的发育情况，探讨该参数对胚胎发育潜力的预测意义。

再根据D5、D6胚胎的发育情况，将行囊胚培养的764枚胚胎分为成囊组(n=558)和未成囊组(n=206)，比较两组胚胎的原核持续时间是否存在差异；考虑到授精方式可能对胚胎的发育动力学参数产生影响，根据不同原核持续时间和授精方式将胚胎进一步分为：≤15 h IVF组(n=216)和>15 h IVF组(n=317)、≤15 h ICSI组(n=103)和>15 h ICSI组(n=128)，分别比较IVF、ICSI受精胚胎在不同原核持续时间囊胚形成相关指标的差异。

进一步将原核持续时间>15 h组细分为3个亚组：>15～17 h组(n=250)、>17～19 h组(n=147)和>19 h组(n=137)，比较各组胚胎发育情况及妊娠结局。

四、统计学方法

结 果

一、不同原核持续时间胚胎的发育情况及移植结局

本研究共纳入TLI系统观测的922枚正常受精胚胎。原核持续时间>15 h组的囊胚形成率、优质囊胚形成率和临床妊娠率较≤15 h组显著下降(P<0.05)，而两组间优质卵裂胚形成率无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 不同原核持续时间组胚胎发育情况及移植结局比较(%)

二、行囊胚培养的胚胎发育情况比较

本研究中共有764枚正常受精胚胎在TLI系统观测下行囊胚培养。

1.不同囊胚培养结局的分组分析：根据D5、D6胚胎发育情况分为成囊组(n=558)和未成囊组(n=206)。统计结果显示，未成囊组的原核持续时间较成囊组显著延长(P<0.05)(表2)。

表2 成囊组与未成囊组原核持续时间比较(-±s)

2.不同原核持续时间及授精方式的分组分析：无论采用IVF或是ICSI受精，原核持续时间>15 h组胚胎的囊胚形成率、优质囊胚形成率均较≤15 h组显著下降(P<0.05)(表3)。

表3 不同原核持续时间/授精方式的胚胎囊胚培养结局比较(%)

三、原核持续时间>15 h的胚胎细化分组分析

3组中，原核持续时间>19 h组的优质卵裂胚形成率较>15～17 h组、>17～19 h组显著下降(P<0.05)；随着原核持续时间的延长，囊胚形成率显著下降(P<0.05)。3组间优质囊胚形成率呈现下降趋势，但无统计学差异(P>0.05)；临床妊娠率在3组间无统计学差异(P>0.05)(表4)。

表4 原核持续时间>15 h的胚胎发育情况亚组分析(%)

讨 论

对胚胎进行评估并筛选出具有发育潜力的胚胎是辅助生殖治疗中较为关键和核心的步骤之一。TLI技术作为非侵入性评估系统，为胚胎学家准确评估和选择优质胚胎提供了新方法。有研究发现，整倍体胚胎与非整倍体胚胎间发育速度存在差异，可将动力学参数作为胚胎优选的候选指标，有望改善临床结局[8]。

原核出现至原核消失的时间段内，胚胎处于活跃的物质准备阶段，需要进行一系列DNA分子的复制和相关蛋白质的合成。本研究结果显示：与原核持续时间≤15 h组相比，>15 h组其囊胚形成率、优质囊胚形成率和临床妊娠率均显著下降(P<0.05)；未成囊组的原核持续时间较成囊组显著延长(P<0.05)；当原核持续时间>15 h，随着时间的延长，囊胚形成率显著下降(P<0.05)，优质囊胚形成率也呈现下降趋势，但尚无统计学差异(P>0.05)。结果提示原核持续时间对于胚胎的成囊情况有一定的预测意义。可能的机制如下：(1)原核持续时间延长可能反映胚胎存在DNA损伤或染色体异常。DNA损伤是一种常见事件，可导致染色体DNA的突变或缺失，继而对后续的胚胎发育产生影响。胚胎发育过程中，若DNA出现损伤，可诱发DNA损伤应答，包括DNA修复、细胞周期检查点激活以及触发凋亡通路[9]，使得细胞周期进程减慢或阻滞细胞周期进程[10]。(2)DNA复制进程迟缓也可能使原核持续时间延长，与线粒体供能不足相关。线粒体产生的ATP是细胞的主要能量来源[11]，ATP作为卵母细胞成熟、受精及胚胎发育的能量保证[12]，对胚胎的发育起着关键作用。越来越多的证据表明，卵母细胞线粒体是各种应激源的关键作用靶点，应激诱导的线粒体功能改变将导致卵母细胞质量及胚胎发育潜力下降[11]。

本研究中，囊胚形成率在原核持续时间>15 h的胚胎分组中随着时间的推移出现显著下降，而优质卵裂胚形成率在原核持续时间>19 h亚组才出现下降趋势。胚胎基因组激活(embryo genome activation，EGA)和转录活跃的开始标志着从卵母细胞到合子基因程序的转变，这一过程在人类胚胎发生在4～8细胞阶段[13]。如前所述，原核持续时间延长可能反映了胚胎存在DNA的突变或缺失，但在早期卵裂阶段，胚胎在转录上是沉默的[14]，DNA异常对胚胎发育的影响在该时期尚未充分体现，仅通过D3发育情况进行胚胎选择存在一定局限性。囊胚形成是胚胎早期发育过程的一个重要阶段，多种基因参与囊胚的分化和发育[15]。Uysal等[16]将与DNA甲基化发生相关的基因Dnmt1、Dnmt3a敲除，发现缺乏这些关键基因的胚胎多数发生退化或停滞于二细胞阶段，只有具备完整且正常激活的基因组，胚胎才有可能发育至囊胚。与D3优胚率相比，原核持续时间的长短可初步判定胚胎是否具有正常的基因组成，因此，在筛选具有发育潜力的胚胎上更占优势。

对于不同授精方式的胚胎，当原核持续时间>15 h，后期发育为囊胚、优质囊胚的可能性均显著下降，该时长对IVF、ICSI胚胎的囊胚发育情况的预测同样有效。IVF中，精子需穿过卵丘细胞和透明带，经历精卵识别、精卵结合以及精卵质膜融合等复杂步骤。ICSI技术借助显微操作系统，直接将单个精子注射入卵母细胞诱导其受精；然而，实施操作前需人工去除卵母细胞周围的卵丘细胞，注射精子时会对卵母细胞产生损伤。与IVF相比，ICSI具有侵入性，侵入性的操作是否影响胚胎发育是胚胎学家较为关心的问题[17]。Sayed等[18]的报道中将IVF与ICSI胚胎的tPNf进行比较，发现IVF胚胎的tPNf较ICSI延迟0.28 h；Cruz等[19]指出，两种授精方式的胚胎早期发育参数存在差异，但该差异是由参数的起点不同所致，与胚胎质量无明显关联。我们的数据表明，原核持续时间并未受授精方式的显著影响，与Cruz等[19]的研究结果一致。

综上所述，无论采用何种授精方式，原核持续时间≤15 h的胚胎囊胚形成率及囊胚质量均显著高于原核持续时间>15 h的胚胎；原核持续时间对胚胎发育潜力有一定的预测价值，有望成为胚胎优选的新指标。本研究的不足在于移植的胚胎数量较少，以及部分随访资料缺失，未将活产率及活产儿后期的健康状况作为结局指标。在未来的探索中仍需进一步扩大样本量来加以验证，还可以通过遗传学分析等手段，去探究不同原核持续时间与胚胎正常核型的关系。