LncRNA-MIAT靶向miR-150-5p对病理性血管化角膜及VEGF、MMP-9的影响△

赵凌军 杨潇远 王新茹 李 季

正常角膜本身无血管存在，当角膜组织受损，维持角膜无血管的平衡因素被破坏，外源血管网会越过角膜缘侵入角膜基质中，这种角膜病理状态即为角膜新生血管(CNV)化[1-2]。CNV患者主要表现为畏光、疼痛、流泪、视物模糊、异物感等症状[3]。目前临床上对活跃生长期新生血管的治疗以药物为主，而角膜病变静止时采用手术治疗，但由于药物使用存在并发症及手术治疗安全性较低等因素，现仍在寻求一种新的安全有效的治疗方式。长链非编码核糖核酸(LncRNA)是一类非编码RNA，在发育、分化和代谢过程中发挥重要生物学作用，心肌梗死相关转录本(MIAT)是一种LncRNA，与眼和脑组织血管结构完整性和神经元功能有关，其异常表达与微血管病变及心肌梗死等多种疾病有关[4-5]。微小核糖核酸(miRNA)参与多种疾病发生发展过程，可通过调控多种细胞因子表达和信号转导途径影响角膜血管新生，与CNV关系密切[6]。LncRNA-MIAT可通过吸附miRNA发挥相关生物学功能，本实验拟通过建立CNV大鼠模型，探讨LncRNA-MIAT对疾病的影响，并阐明其作用机制，为CNV的靶向治疗提供新型治疗方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞大鼠角膜上皮细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。细胞接种于含有100×103U·L-1青霉素、0.1 g·L-1链霉素和体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。

1.1.2 实验动物SPF级7周龄雄性SD大鼠100只，体重(200±20)g，购自上海杰思捷实验动物有限公司[生产许可SCXK(沪)2018-0004]，保持温度25 ℃、相对湿度50%～75%，12 h/12 h明暗循环。实验前采用裂隙灯检查，剔除眼部有病变的大鼠。

1.1.3 主要试剂及仪器左氧氟沙星滴眼液(参天制药株式会社)，过表达LncRNA-MIAT(MIAT)、短发卡RNA(shRNA)干扰LncRNA-MIAT(sh-MIAT)和LncRNA-MIAT阴性对照(MIAT-NC)-pcDNA3.0(上海北诺生物科技有限公司)，脂质体LipofectamineTM2000转染试剂盒(美国Invitrogen公司)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-8 ELISA检测试剂盒(上海优选生物科技有限公司)，兔抗大鼠血管内皮生长因子(VEGF)一抗(美国Chemicon公司)，兔抗大鼠基质金属蛋白酶-9(MMP-9)一抗(北京百奥莱博科技有限公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(美国Jackson Immuno Research公司)，OST-BD2800显微镜(苏州鸥斯特光学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分组建模前1 d所有大鼠眼部滴加左氧氟沙星滴眼液预防感染，随机选取80只大鼠，以碱烧伤法建立CNV模型[7]。选取大鼠右眼为实验眼，20 g·L-1戊巴比妥腹腔注射麻醉，丁卡因麻醉眼部，开大眼睑，并放平眼球，取直径3.0 mm的圆形滤纸片，经紫外线消毒后，浸于1 mol·L-1NaOH溶液中10 s并取出，贴敷于右侧眼球角膜较中央位置，50 s后取下，无菌生理盐水冲洗结膜囊2 min，可见角膜中央有灰白色斑，虹膜纹理模糊，表明建模成功。大鼠均建模成功，且均未出现角膜感染及穿孔。建模结束后所有大鼠双眼滴加左氧氟沙星滴眼液防止感染，每天3次，共14 d。将建模成功大鼠按随机数字表法分为模型组、MIAT组、sh-MIAT组和MIAT-NC组，每组各20只(20眼)。另取20只大鼠为对照组，用生理盐水代替NaOH，其余步骤同建模大鼠。

1.2.2 干预分别将MIAT、sh-MIAT、MIAT-NC-pcDNA3.0和LipofectamineTM2000转染试剂稀释后充分混匀，于造模后2 h内进行质粒转染。大鼠麻醉后，MIAT组、sh-MIAT组和MIAT-NC组分别经玻璃体内注射稀释MIAT、sh-MIAT和MIAT-NC-pcDNA3.0质粒4 μL，对照组及模型组注射等量生理盐水，36 h后进行后续实验。

1.2.3 RT-PCR检测角膜LncRNA-MIAT、miR-150-5p表达情况每组随机取5只大鼠，摘取右眼角膜，用Trizol法提取总RNA。经反转录试剂盒反转录为cDNA，进行PCR扩增：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35个循环。以2-△△Ct法对LncRNA-MIAT、miR-150-5p表达情况进行相对定量。引物序列：LncRNA-MIAT上游引物：5’-CTTCCAGAGTCATCCTGTGG-3’，下游引物：5’-CCAAGGGATCCCCAAGGCTC-3’；GAPDH上游引物：5’-TCCCCATCACCATCTTCCAGG-3’，下游引物：5’-GATGACCCTTTTGGCTCCC-3’；miR-150-5p上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG CACTGGTA-3’；U6上游引物：5’-AAGGAGACGACGACAGAC-3’，下游引物：5’-GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3’。

1.2.4 双荧光素酶实验验证LncRNA-MIAT与miR-150-5p的靶向关系利用miRcode搜索与LncRNA-MIAT相关的基因，预测MIAT的潜在靶点，并选择miR-150-5p作为可能靶点。将MALAT-WT(野生型)和MALAT-MUT(突变型)3’UTR插入pmirGLO载体，构建MALAT-WT和MALAT-MUT荧光素酶报告基因。转染前24 h将对数生长期大鼠角膜上皮细胞以每孔1.5×105个·mL-1接种于96孔板，培养至70%融合时转染，使用LipofectamineTM2000，将MALAT-WT和MALAT-MUT荧光素酶报告质粒与miR-150-5p mimic/miR-150-NC共转染至大鼠角膜上皮细胞，孵育48 h，检测荧光素酶强度，计算相对荧光素酶活性，相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.2.5 ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8水平每组分别另取5只大鼠，脱颈处死，取右眼角膜剪碎置于匀浆器中，按照ELISA试剂盒操作，于450 nm波长处读取酶标仪光密度，根据标准曲线，计算TNF-α、IL-6、IL-8水平。

1.2.6 HE染色观察角膜病理变化各组取5只大鼠，处死后，取右眼角膜，40 g·L-1多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋并切片(4 μm)，二甲苯脱蜡，梯度浓度酒精脱水，苏木素染色10 min，水洗后伊红溶液染色30 s；酒精脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察角膜病理变化。

1.2.7 Western blot检测VEGF、MMP-9的表达情况各组剩余大鼠处死后取右眼角膜，加入RIPA裂解液裂解，离心后取上清，BCA法进行蛋白定量。制备SDS-PAGE凝胶，蛋白变性，电泳，转膜后，用50 g·L-1脱脂牛奶室温封闭2 h。加入VEGF、MMP-9一抗(12000)，4 ℃孵育过夜；洗涤后加入二抗(14000)，室温孵育2 h。ECL显影，定影。以GAPDH为内参，用ImageJ软件分析VEGF、MMP-9的相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠角膜组织中LncRNA-MIAT、miR-150-5p的表达水平比较对照组、模型组、MIAT-NC组、MIAT组和sh-MIAT组大鼠角膜组织中LncRNA-MIAT、miR-150-5p相对表达水平多组间比较，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。与对照组比较，模型组LncRNA-MIAT相对表达水平升高，miR-150-5p相对表达水平降低(P<0.05)；与模型组和MIAT-NC组比较，MIAT组LncRNA-MIAT相对表达水平升高，miR-150-5p相对表达水平降低，sh-MIAT组LncRNA-MIAT相对表达水平降低，miR-150-5p相对表达水平升高(均为P<0.05)；模型组与MIAT-NC组LncRNA-MIAT、miR-150-5p相对表达水平比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。

2.2 双荧光素酶实验验证结果MALAT-WT、MALAT-MUT与miR-150-5p mimic/miR-150-NC共转染后，相对荧光素酶活性组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与共转染miR-150-NC的MALAT-WT相对荧光素酶活性(1.02±0.11)比较，共转染miR-150-5p mimic的MALAT-WT相对荧光素酶活性(0.24±0.05)显著降低(t=11.583，P=0.001)，而共转染miR-150-5p mimic的MALAT-MUT相对荧光素酶活性(1.06±0.11)与miR-150-NC(1.02±0.12)无明显差异(t=0.426,P=0.692)。

表1 各组大鼠角膜组织中LncRNA-MIAT、miR-150-5p相对表达水平比较

2.3 各组大鼠角膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8水平比较对照组、模型组、MIAT-NC组、MIAT组和sh-MIAT组大鼠角膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8水平多组间比较，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。与对照组比较，模型组大鼠角膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8水平均升高(均为P<0.05)；与模型组和MIAT-NC组比较，MIAT组大鼠角膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8 水平均升高，sh-MIAT组大鼠角膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8水平均降低(均为P<0.05)。模型组与MIAT-NC组大鼠角膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8水平比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表2)。

表2 各组大鼠角膜组织中TNF-α、IL-6、IL-8水平比较

2.4 各组大鼠角膜组织病理变化HE染色结果显示：对照组大鼠角膜基质纤维排列整齐，上皮细胞无破坏，无炎症细胞浸润；模型组大鼠角膜基质层数明显增多，有炎症细胞浸润；MIAT组大鼠角膜基质层偏厚，可见中性粒细胞，炎症细胞浸润程度高于模型组；MIAT-NC组大鼠角膜组织病理变化与模型组相似，有大量炎症细胞浸润；sh-MIAT组大鼠角膜组织基质纤维排列较整齐，上皮细胞破坏减少，炎症细胞浸润减少，病理变化较模型组明显减轻(图1)。

图1 HE染色观察各组大鼠角膜组织病理变化(×400) A：对照组；B：模型组；C：MIAT-NC组；D：MIAT组；E：sh-MIAT组。

2.5 各组大鼠角膜组织中VEGF、MMP-9蛋白相对表达水平比较对照组、模型组、MIAT-NC组、MIAT组和sh-MIAT组大鼠角膜组织中VEGF、MMP-9蛋白相对表达量多组间比较，差异均有统计学意义(均为P<0.001)(图2、表3)。与对照组比较，模型组大鼠角膜组织中VEGF、MMP-9蛋白相对表达量均升高(均为P<0.05)；与模型组和MIAT-NC组比较，MIAT组大鼠角膜组织中VEGF、MMP-9蛋白相对表达量均升高；sh-MIAT组大鼠角膜组织中VEGF、MMP-9蛋白相对表达量均降低(均为P<0.05)；模型组与MIAT-NC组大鼠角膜组织中VEGF、MMP-9蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

图2 Western blot检测各组大鼠角膜组织中VEGF、MMP-9蛋白相对表达情况

表3 各组大鼠角膜组织中VEGF、MMP-9蛋白相对表达情况

3 讨论

CNV的发生主要与创伤、感染、免疫反应等因素有关[8]。有研究发现[9]，对无血管化的角膜患者进行异体移植，存活率可达90%，而对血管化角膜进行移植，存活率则大大降低。新生血管对清除感染、促进伤口愈合、抑制免疫介导的角膜溶解等具有重要作用，而新生血管过度生长除了影响患者视力外，对于接受过角膜移植手术的患者而言，还可因角膜基质血管化程度的增加，对角膜微环境造成破坏，从而影响角膜的免疫赦免现象，增加角膜移植后的排斥反应，威胁患者生命健康[10]。靶向治疗是一种新型治疗方案，本研究基于LncRNA-MIAT与血管病变的关系，旨在为CNV的靶向治疗提供思路。

LncRNA-MIAT与多种疾病密切相关，通过敲低LncRNA-MIAT水平可抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖、侵袭及裸鼠移植瘤生长[11]。任成龙等[12]研究显示，LncRNA-MIAT作为竞争性内源性RNA，与血管内皮细胞炎症反应有关，具有促炎作用。研究表明[13]，LncRNA-MIAT可抑制相关miRNA的表达，提高血管平滑肌细胞活力，通过靶向抑制LncRNA-MIAT，可预防糖尿病大血管病变的发生。miR-150-5p参与血管病变过程，可通过调节VEGF表达，减轻动脉粥样硬化[14]。本研究结果显示，与对照组比较，MIAT组大鼠角膜组织LncRNA-MIAT表达升高，miR-150-5p表达降低，同时存在明显炎症反应，角膜组织病变严重，表明高表达的LncRNA-MIAT参与CNV发生发展过程，并可能参与调控miR-150-5p表达。进一步经过表达和敲降LncRNA-MIAT表达后，LncRNA-MIAT和miR-150-5p表达发生相应变化，同时炎症反应及病理学变化也随着LncRNA-MIAT表达升高和降低而相应严重和减轻，表明敲降LncRNA-MIAT可减轻CNV大鼠炎症反应，改善角膜组织病理变化。另外，双荧光素酶实验结果显示，miR-150-5p是LncRNA-MIAT的直接靶向miRNA，进一步提示LncRNA-MIAT可通过靶向调节miR-150-5p参与CNV过程。

VEGF是最重要的调控介质之一，与血管生成密切相关，在多种病理性新生血管疾病中，VEGF水平显著上调。MMP-9则通过释放VEGF参与血管生成，可通过下调MMP-9转录水平，抑制CNV的形成。在结直肠癌疾病中，通过转染VEGF表达质粒，可解除miR-150-5p对血管生成的抑制作用。LncRNA-MIAT是多种眼部血管病变共有调控因子，过表达时可与miR-150-5p结合，从而影响VEGF的表达，当LncRNA-MIAT表达下调时，miR-150-5p与VEGF mRNA结合，使得VEGF的表达受到抑制，从而减少眼部血管新生疾病的发生、发展，减缓疾病进程[15]。LncRNA-MIAT的敲低可改善糖尿病引起的视网膜微血管功能障碍，并抑制内皮细胞增殖、迁移及血管形成[16]。此外，LncRNA-MIAT沉默时，还可降低MMP-9的转录活性，从而抑制非小细胞肺癌的增殖、转移[17-18]。本研究结果显示，过表达LncRNA-MIAT后，VEGF和MMP-9蛋白表达相应升高，而敲降其表达水平后，VEGF和MMP-9表达随之降低，提示LncRNA-MIAT参与CNV过程可能与调节VEGF和MMP-9表达，参与血管新生有关。

综上所述，敲降LncRNA-MIAT表达可减轻CNV大鼠炎症反应，减轻血管新生，可能与靶向调控miR-150-5p，进而影响VEGF和MMP-9蛋白表达有关。本研究结果可为临床CNV的靶向治疗提供新的方向。