藏红花素对视网膜缺血再灌注损伤小鼠视网膜神经节细胞的保护作用及其机制研究△

齐 赟 张艺馨 程育宏

视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)是很多眼科疾病共同的病理损伤过程，如青光眼、视网膜动静脉阻塞、缺血性视神经病变等。RIRI会造成视网膜神经节细胞(RGC)损伤，因此，研究RIRI病理损伤的过程，探索保护RGC的药物，对于以上疾病的治疗具有重要的意义。

藏红花是我国传统名贵药材，目前已经发现其药理成分具有神经保护、抗抑郁、心肌保护、增强记忆的功效[1]。藏红花素(分子式：C44H64O24)是藏红花最主要的药理活性成分[2]，我们前期的研究表明，藏红花素对RIRI大鼠的RGC具有保护作用[3-4]。小鼠较大鼠繁殖快、研究用途多，但藏红花素对RIRI小鼠的RGC是否具有保护作用，目前并不清楚。

NLRP3炎症小体由3个部分构成，分别是含NOD、LRR和pyrin结构域的蛋白质3(NLRP3)、含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1,NLRP3炎症小体的活化可以激活Caspase-1,裂解白细胞介素1β (IL-1β)，促进IL-1β的成熟和释放[5]。我们前期的研究结果表明，大鼠RIRI会活化NLRP3炎症小体，促进IL-1β的表达，从而促进RGC的凋亡[6]。Zhang等[7]研究发现，藏红花素可以抑制脂多糖(LPS)诱导的焦虑及抑郁小鼠大脑的NLRP3炎症小体。因此，本研究拟探讨藏红花素对RIRI小鼠RGC是否具有保护作用，及NLRP3炎症小体通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组健康雄性 C57BL/6小鼠(10～12周龄)144只，由西安交通大学医学部动物中心提供。实验动物及实验使用条件均符合《实验动物管理条例》。所有操作均在小鼠全身麻醉情况下进行，使用100 g·L-1的水合氯醛以5 mL·kg-1的剂量腹腔注射麻醉，均取右眼为实验眼，使用复方托吡卡胺滴眼液(沈阳兴齐眼药股份有限公司)散瞳，恒温板设置为 37 ℃。小鼠随机分为 3 组：假手术组、模型组、藏红花素治疗组。

1.2 主要试剂藏红花素(#PHL80391-10MG,Sigma-Aldrich，美国),抗RBPMS抗体(#15187-1-AP，武汉三鹰),抗NLRP3抗体(#91525,11000,Abcam，美国),抗ASC抗体(#127537,11000,Abcam，美国),抗Caspase-1抗体 (#108362,11000,Abcam，美国),抗IL-1β抗体 (#9787,11000,Abcam，美国),抗β-actin抗体 (#4970,11000,CST，美国)，辣根酶标记山羊抗兔IgG(13000，万类生物科技)。

1.3 藏红花素给药将藏红花素溶于生理盐水中配置成5 g·L-1溶液，藏红花素治疗组小鼠于造模前 30 min腹腔内注射藏红花素溶液50 mg·kg-1，假手术组及模型组小鼠给予腹腔注射等体积生理盐水。

1.4 动物模型建立模型组和藏红花素治疗组小鼠全身麻醉后置于恒温板上，用胶布固定小鼠的头部及四肢，右眼滴表面麻醉剂(盐酸丙美卡因滴眼液)及散瞳剂(复方托吡卡胺)。将装有100 mL无菌生理盐水的输液瓶与一次性无菌胰岛素注射器通过输液器相连，排尽输液器内的空气。待瞳孔散大后，手持针头平行于小鼠身体纵轴沿颞侧角膜缘进针。用胶布固定好针头后，打开输液器水闸，缓慢升高输液瓶，使其最终距离小鼠的高度为 150 cm，这个高度所形成的眼压为 110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)。输液瓶升高后，可以观察到小鼠虹膜和眼底变苍白，表明视网膜缺血形成。缺血1 h后，降低输液瓶高度，拔出针头，此时虹膜与眼底血流恢复，即视网膜再灌注形成。实验中将湿润的棉花片置于角膜上，防止角膜干燥。拔出针头后，小鼠角膜涂抹红霉素软膏。假手术组小鼠操作步骤同前，但是不打开输液器水闸，因此该组小鼠的眼压是正常的。

1.5 视网膜铺片染色每组随机选取6只小鼠于RIRI后14 d水合氯醛麻醉，颈椎脱臼法处死。摘取小鼠眼球后，于40 g·L-1多聚甲醛中固定1 h后，弃角膜、晶状体、玻璃体，剥离出完整的视网膜，将视网膜继续在40 g·L-1多聚甲醛中固定1 h，之后磷酸盐缓冲液(PBS)洗10 min×3次。将视网膜放置于含有5 g·L-1Triton、10 g·L-1二甲基亚砜、10 g·L-1牛血清白蛋白的PBS溶液中4 ℃过夜，PBS洗涤后，一抗孵育过夜(RBPMS,1200)，PBS洗涤后，孵育二抗(CY3,1100)2 h，PBS洗涤后，将视网膜平铺于载玻片(按象限剪为四瓣平铺，分别为鼻上、鼻下、颞上、颞下)，体积分数50%甘油封片，荧光显微镜照相。在荧光显微镜下(放大 20 倍)，观察每一个象限中距离视神经 1.5 mm 处的 RGC数目，记录四个象限平均RGC数。每张图片中的 RGC分别由两个观察员进行计数，取均值记录。

1.6 HE染色RIRI后24 h，各组随机选取6只小鼠水合氯醛麻醉，摘取小鼠眼球后，颈椎脱臼法处死。弃角膜、晶状体、玻璃体后，将视杯置于40 g·L-1多聚甲醛中固定，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋后切片，切片厚度为4 μm，之后进行烤片。石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，冲洗后苏木精染色5 min，自来水冲洗，盐酸酒精分化数秒，自来水返蓝，伊红染色5 min，无水酒精脱水后，于二甲苯中透明数分钟，体积分数50%甘油封片，之后于生物显微镜(Eclipse Ci-L，日本)下观察视网膜内层厚度的改变。视网膜内层包括视网膜神经节细胞层(GCL)、内丛状层、内核层(INL)。

1.7 多重基因定量分析系统检测基因表达于RIRI后0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和15 h，水合氯醛麻醉后颈椎脱臼法处死小鼠，每个时间点各组随机取3只小鼠视网膜组织检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β mRNA的表达。使用多重基因定量分析系统(Affymetrix,Fremont,CA,美国)检测靶标基因的表达，裂解后的视网膜组织中的各基因可以被荧光微球捕获，通过Luminex100xMAP技术将荧光信号放大，之后通过BioPlex 5.0软件(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,美国)分析。管家基因PPIB做标准化处理。所有实验重复3次。

1.8 Western blot检测于RIRI后6 h和12 h，各组随机选取6只小鼠水合氯醛麻醉，颈椎脱臼法处死。摘取小鼠眼球后，弃角膜、晶状体、玻璃体，剥离出视网膜。提取视网膜蛋白后BCA法蛋白定量。于120 g·L-1SDS-PAGE预制胶中，每孔加入50 μg蛋白样品。100 V电泳1 h后转膜。5 g·L-1脱脂奶粉(TBST缓冲液溶解)封闭后，加入一抗(抗NLRP3抗体、抗ASC抗体、抗Caspase-1抗体、抗IL-1β抗体或抗β-actin抗体，稀释度均为11000)，4 ℃过夜。TBST洗3次后加二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG孵育1.5 h，TBST洗3次后Western blot检测各蛋白表达。实验重复3次，将胶片扫描，用ImageJ 软件对曝光的条带进行灰度分析，并进行统计学处理。

1.9 ELISA检测于RIRI后6 h和12 h，每组各随机选取6只小鼠水合氯醛麻醉，颈椎脱臼法处死。摘取小鼠眼球后，弃角膜、晶状体、玻璃体，剥离出视网膜，使用ELISA 法(CUSABIO,武汉)检测视网膜组织中的IL-1β的含量。获取视网膜组织后，溶于200 μL的PBS溶液中，匀浆，2500 r·min-1离心5 min，取上清100 μL，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-1β的含量，在450 nm处测光密度，并根据标准品换算样品浓度。

2 结果

2.1 藏红花素对小鼠RIRI后RGC的保护作用RIRI后14 d，以假手术组小鼠RGC密度为参照，模型组小鼠RGC密度为假手术组的11.2%±5.6%，藏红花素治疗组小鼠RGC的密度为假手术组的29.7%±8.4%，藏红花素治疗组小鼠较模型组小鼠RGC密度增加约18.5%。模型组小鼠较假手术组小鼠RGC密度显著降低(P<0.001)，藏红花素治疗组小鼠较模型组小鼠RGC密度显著增加(P<0.05)(图1)。表明藏红花素对小鼠RIRI后的RGC具有显著的保护作用。

图1 视网膜铺片染色显示各组小鼠视网膜RGC A：假手术组；B：模型组；C：藏红花素治疗组。

2.2 藏红花素对视网膜内层厚度的影响HE染色结果显示，RIRI后24 h，模型组小鼠视网膜内层厚度为假手术组的(2.1±0.2)倍(P<0.01)。而藏红花素治疗组小鼠视网膜内层厚度为假手术组的(1.1±0.2)倍，较模型组显著降低(P<0.01)(图2)。表明使用藏红花素治疗的RIRI小鼠，其视网膜内层的水肿明显减轻。

图2 HE染色检测各组小鼠视网膜内层厚度 A：假手术组；B：模型组；C：藏红花素治疗组。双向箭头示视网膜内层厚度。ONL：外核层。

2.3 藏红花素对各因子mRNA表达的影响模型组小鼠视网膜组织中NLRP3以及ASC mRNA表达在RIRI后3 h、6 h、9 h、12 h、15 h与RIRI 0 h相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。模型组小鼠视网膜组织中Caspase-1 mRNA表达在RIRI后6 h、9 h、12 h与RIRI 0 h相比差异均有统计学意义(均为P<0.001)。模型组小鼠视网膜组织中IL-1β mRNA表达在RIRI后6 h、9 h、12 h、15 h与RIRI 0 h相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3)。藏红花素治疗组小鼠视网膜组织中Caspase-1 mRNA表达在RIRI后6 h、9 h与RIRI 0 h相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。藏红花素治疗组小鼠视网膜组织中IL-1β mRNA表达在RIRI后6 h、9 h、12 h与RIRI 0 h相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图4)。与模型组相比，藏红花素治疗组小鼠视网膜组织中Caspase-1及IL-1β mRNA表达在RIRI后6 h、9 h、12 h均显著降低(均为P<0.05)。

图3 多重基因定量分析系统检测模型组小鼠RIRI后不同时间视网膜组织中各因子mRNA表达 A:NLRP3 mRNA的表达变化；B:ASC mRNA的表达变化；C:Caspase-1 mRNA的表达变化；D:IL-1β mRNA的表达变化。

图4 多重基因定量分析系统检测藏红花素治疗组小鼠RIRI后不同时间视网膜组织中各因子mRNA表达。 A:Caspase-1 mRNA的表达变化；B:IL-1β mRNA的表达变化。

2.4 藏红花素对各因子蛋白表达的影响Western blot检测结果显示，RIRI后6 h及12 h，模型组、藏红花素治疗组小鼠视网膜组织中NLRP3及ASC蛋白表达均较假手术组无显著变化(均为P>0.05)。RIRI后6 h及12 h模型组小鼠视网膜组织中Caspase-1以及IL-1β蛋白表达较假手术组均显著升高，而藏红花素治疗组小鼠RIRI 6 h及12 h视网膜组织中Caspase-1以及IL-1β蛋白表达较模型组均显著下降(均为P<0.05)(图5)。表明藏红花素可以降低RIRI后小鼠视网膜组织中Caspase-1以及IL-1β蛋白表达。

2.5 ELISA检测视网膜组织中IL-1β蛋白表达RIRI后6 h及12 h，模型组小鼠视网膜组织中IL-1β蛋白表达较假手术组显著升高(均为P<0.001)。与模型组相比，藏红花素治疗组小鼠RIRI后6 h以及12 h视网膜组织中IL-1β蛋白表达均显著下降(均为P<0.05)(图6)。进一步证实藏红花素可以降低RIRI小鼠视网膜中IL-1β蛋白表达。

图5 Western blot检测各组小鼠视网膜组织中各因子蛋白表达 A：Western blot电泳图；B：NLRP3蛋白表达统计图；C：ASC蛋白表达统计图；D：Caspase-1蛋白表达统计图；E：IL-1β蛋白表达统计图。与假手术组相比，###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05；与模型组相比，***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05。

图6 ELISA检测各组小鼠视网膜组织中IL-1β蛋白表达统计图 与假手术组相比，###P<0.001；与模型组相比， ***P<0.001，*P<0.05。

3 讨论

本研究的主要发现可以概括为以下两点：(1)腹腔注射藏红花素可以显著增加RIRI小鼠视网膜RGC数目、降低RIRI视网膜内层厚度；(2)藏红花素可以显著抑制RIRI后小鼠视网膜内Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白的表达水平。

藏红花是我国传统名贵药材，现代医学通过提取其活性成分，发现其具有神经保护、抗抑郁、心机保护、增强记忆的功效。藏红花素是藏红花主要活性成分之一，研究发现其在帕金森果蝇模型、哌醋甲酯引起的神经行为和神经化学后遗症[8]、阿尔茨海默病小鼠[9]中均具有神经保护作用。已经有研究发现藏红花素可以增加大鼠视网膜的血流[10]，保护大鼠光感受器细胞[11]。我们之前的研究也表明[3]，50 mg·kg-1的藏红花素对RIRI的大鼠RGC具有保护作用。藏红花素的视网膜神经保护作用主要集中在大鼠领域。小鼠较大鼠繁殖快、研究用途多，但藏红花素对RIRI小鼠的RGC是否具有保护作用目前并不清楚。本研究结果表明，50 mg·kg-1的藏红花素对RIRI小鼠RGC同样具有保护作用，藏红花素治疗组较模型组小鼠RGC密度增加约18.5%，与之前藏红花素在RIRI大鼠RGC中的作用相似(19%)[3]。

本研究发现，RIRI后3 h、6 h、9 h、12 h、15 h，模型组小鼠视网膜组织中NLRP3、ASC mRNA表达无显著变化，而Caspase-1和IL-1β mRNA表达出现显著的变化，且在RIRI后6 h达峰值。这个结果非常有趣，因为Caspase-1和IL-1β的活化主要依赖于NLRP3炎症小体[5]。而本研究结果表明，RIRI后模型组视网膜组织中Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白表达均显著升高，但是NLRP3和ASC的表达却没有显著变化。近年来有研究表明，Caspase-11非经典炎症小体也可以活化Caspase-1以及IL-1β[12]。而本研究中，Caspase-1以及IL-1β的活化是否依赖于Caspase-11，还需要进一步的证实。我们前期的研究表明，大鼠RIRI会活化NLRP3炎症小体，促进IL-1β的表达[6]。因此我们推测，参与小鼠RIRI Caspase-1和IL-1β活化的机制与大鼠可能并不相同。

本研究发现，藏红花素可以显著抑制RIRI后小鼠视网膜组织中Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白的表达。在Zhang等[7]研究中，藏红花素可以降低LPS诱导后小鼠海马内升高的Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白，这与本研究结果一致。IL-1β是参与RIRI非常重要的炎症因子， Caspase-1是激活IL-1β的上游因子[13]。RIRI后3～12 h，视网膜组织中IL-1β表达显著升高，而提前玻璃体内注射IL-1β拮抗剂可以降低RIRI损伤所致的RGC的凋亡[9]。因此，在RIRI中，Caspase-1通过活化IL-1β造成RGC的凋亡。而本研究发现，藏红花素可以显著抑制RIRI后小鼠视网膜内Caspase-1和IL-1β mRNA及蛋白的表达，且藏红花素对小鼠RIRI的RGC具有保护作用。因此我们推测，藏红花素通过抑制Caspase-1和IL-1β保护小鼠RIRI后的RGC。

本研究的不足之处：(1)本研究没有使用Caspase-1以及IL-1β的激动剂进一步阐明其作用机制；(2)本研究缺少免疫组织化学实验进一步证实Caspase-1以及IL-1β发挥作用的细胞部位。但是，本研究从视网膜结构水平阐明了藏红花素对小鼠RIRI后RGC的保护作用，并且初步研究了其发挥作用相关的机制：藏红花素通过抑制视网膜组织中Caspase-1和IL-1β的表达保护RIRI小鼠RGC。本研究为进一步探索藏红花素的视网膜神经保护作用奠定了基础。