玉米杂交种北青340及亲本指纹图谱构建

陈国立, 张瑞平, 许卫猛, 孙 佩, 魏常敏, 邢永锋

(1.周口市农业科学院， 河南 周口 466001; 2.新乡市农业科学院， 河南 新乡 45300)

玉米是粮、经、饲兼用型的农作物，具有不可取代的作用[1]，玉米持有量是检验畜牧业和人民生活质量的主要指标[2-3]。种子是农业的芯片，玉米种子质量问题不仅关系着农民的切身利益，而且关系着我国粮食安全[4]。近年来，我国玉米种植面积不断扩大，玉米新品种数量也逐年增多，但是我国玉米种质资源来源相对集中，遗传基础狭窄，导致一些玉米新品种性状相似，田间表型性状很难区分[5]。因此，从分子水平上建立准确有效的玉米品种真实性鉴定技术体系显得非常必要[4]。简单重复序列(SSR)[6]在真核生物基因组中分布随机且广泛[7-8]，呈共显性，具有多态性高，重复性和稳定性好的特点，且操作相对简单，成本较低[9]，在玉米品种真实性鉴定和指纹图谱构建中有着广泛应用[10]。王凤格等[11]利用筛选出的40对SSR核心引物对3998份中国审定的品种建立了DNA指纹库[1]；倪维晨等[12]从30对SSR引物中筛选出10对引物，初步构建了常熟市10份糯性鲜食小玉米自交系指纹图谱；王蕾等[13]利用17对SSR引物对32份黄瓜品种进行分析，为每一份材料建立了一份独特的DNA指纹图谱，为黄瓜新品种选育及品种鉴定提供了重要依据；高闰飞等[14]利用两对多态性好的引物构建了73份紫心甘薯品种的指纹图谱；邱红波等[15]从34对核心引物中选出6对，建立了喀斯特山区玉米自交系的指纹图谱。

北青340是郑州北青种业有限公司用BQ 58-2×JG 67培育而成的优良玉米杂交种，于2018年通过国家审定(国审玉20180106)。本研究用40对玉米核心引物，通过SSR标记技术对北青340以及其父、母本进行分析，从中筛选出条带清晰且互补的引物构建成北青340以及其亲本的指纹图谱。同时用数字“0”和“1”建立数据库，将图谱数字化，并根据相关公式计算出现相同指纹的概率，为快速有效鉴定市场流通的北青340种子的真实性提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和主要试剂

北青340及其亲本来自郑州北青种业有限公司。CTAB、2×PCR Mix、丙烯酰胺等药品购买于上海生工股份有限公司。40对玉米核心引物序列来自玉米基因组数据库(http://www.maizegbd.org/ssr.php),并通过上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1DNA提取

于苗期取北青340及其亲本的叶片适量，于液氮中快速研磨至粉末状，用CTAB方法提取总DNA[16]，加400 μL TE缓冲液，4 ℃备用，-20 ℃长期保存。

1.2.2PCR及电泳分析

PCR反应总体积为15 μL，2×PCR Mix 7.5 μL，DNA 1 μL，引物1 μL，灭菌超纯水5.5 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性6 min，94 ℃ 40 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，35个循环，72 ℃延伸10 min[17]。

在扩增产物中加入2 μL上样缓冲液，于微孔板离心机中混匀。于8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶上样4 μL，电压150 V电泳检测扩增产物。最后用银染显色，相机拍照保存并分析图片。

1.2.3指纹图谱构建及数字化

根据PCR扩增结果，筛选带型稳定、清晰且亲本互补的引物，用于构建北青340及其亲本的指纹图谱，并用数字“0”和“1”表示在相同迁移位置条带的“无”和“有”两种情况，将北青340及其亲本的指纹图谱数字化。并根据公式P=1/2n计算相同指纹图谱有可能出现的概率[16-17]，其中公式中“2”为相同迁移率位点上等位基因“有”和“无”两种情况；“n”表示等位基因的数目；2n表示检测n个等位基因时可能涉及的所有玉米自交系的数目。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选

40对玉米SSR核心引物中有7对引物带型清晰、稳定，此7对引物可以用来构建杂交种北青340及其亲本指纹图谱。结果显示，这7对引物检测出等位基因25个，平均每对引物检测到3.57个等位基因，从图1可看出,这些等位基因片段大小在100～500 bp之间，且这7对引物分布在5条染色体上(表1)。

表1 用于构建北青340指纹图谱引物信息

注：父为父本JG67;340为北青340；母为母本BQ 58-2，下方是对应的引物，M为Mark。

2.2 北青340及其亲本指纹图谱构建

根据40对核心引物在北青340及其亲本的扩增结果中挑选出7对引物用于构建北青340的指纹图谱(图1)，分别是：umc 1147 y 4、bnlg 1671 y 17、umc 1999 y 3、phi 299852 y 2、umc 1936 k 4、umc 2163 w 3、bnlg 2291 k 4。由图1可看出，这7对引物扩增的带型清晰，且父母本互补，正好印证了SSR分子标记共显性的遗传特点[20]。

2.3 指纹图谱数字化

根据筛选出的7对引物所构建的北青340及其亲本的指纹图谱(图1)，分别用“1”和“0”表示在相同位点有带和无带，将北青340及其亲本的指纹图谱数字化，并根据公式P=1/2n计算与其相同指纹的概率。由表2可知，出现与北青340及其亲本指纹图谱相同图谱的概率为2.98×10-8，概率极低。结果证明这7对引物所构建的北青340及其亲本的指纹图谱可用于其真实性鉴定。

表2 北青340及其亲本的数字化指纹

3 讨 论

玉米作为我国第一大作物，在保障国家粮食安全和生产中具有举足轻重的地位[21]。玉米品种是决定玉米产量和品质的关键因素[22]。因此，保护和创新玉米种质资源对推动玉米产业的发展具有重要意义[12]。SSR分子标记具有多态性高、重复性好、费用相对较低等特点，在新品种真实性和纯度鉴定、指纹图谱构建等方面发挥着重要作用[23]。目前已经成功运用于棉花[24]、玉米[17]、烟草[25]、梨[26]，甘薯[14]等多种农作物的指纹图谱构建。

本研究为构建北青340及其亲本的指纹图谱，利用分子标记技术对40对玉米SSR核心引物进行分析，从中筛选出7对带型清晰稳定的引物，并将其所构建的北青340及其亲本的指纹图谱数字化，计算得出与其相同指纹图谱的概率为2.98×10-8， 这个概率是非常低的。因此，这7对引物所构建北青340及其亲本的指纹图谱是特有的，在生产中，可从中随机挑选1～2对用来鉴定玉米杂交种北青340及其亲本的真实性。