都匀毛尖茶非靶向代谢组学研究
2022-02-24王春波韦玲冬郭治友
王春波, 吕 辉, 韦玲冬, 郭治友
(黔南民族师范学院生物科学与农学院, 贵州 都匀 558000)
茶树(Camelliasinensis(L.) O. Kuntze)是山茶科山茶属常绿植物,作为一种重要的经济作物广泛栽培[1]。茶中含有大量可溶性物质,例如儿茶素、咖啡因、茶氨酸、多酚、有机酸和维生素等,这些物质的含量直接影响茶叶的质量[2]。另外,根据加工方式的不同,茶叶又分为绿茶、白茶、红茶、黑茶、黄茶和乌龙茶等不同类型[3]。Dai等[4]研究表明,不同类型茶叶之间代谢物含量差异较大。基于此,研究不同茶树品种叶片中代谢物含量的差异尤为重要。
都匀毛尖是中国十大名茶之一[5]。1915年,都匀毛尖茶获得国际食品博览会优质奖。都匀毛尖野生茶树主要分布于贵州省黔南州都匀市和贵定县等地,茶树叶色鲜绿,叶芽壮实肥大,形状秀丽,茸毛较多,内含物丰富,是优良的育种资源[6]。关于都匀毛尖茶的研究多集中在资源调查和香气成分等方面[7-8],代谢组学方面的研究鲜有报道。目前,研究代谢组的方法很多,其中超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)技术具有高通量和高灵敏度的特性,已经广泛用于茶叶代谢物的定性和定量测定[9-11]。鉴于此,利用UPLC-QTOF/MS代谢组学技术,结合统计和多元数据分析方法,研究都匀毛尖茶不同品种间的代谢差异,可为都匀毛尖茶的加工工艺改良、滋味品质提升和功能性成分富集等方面提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
都匀毛尖茶大叶种(长椭圆形叶片棕色茎,BS)和小叶种(椭圆形叶片绿色茎,GS)茶树样品于2018年4月采自贵定县云雾镇茶场(26°34′48″N,107°13′52″E)。每个品种随机挑选9株茶树并采集新鲜叶片样品,共18个样品。乙腈、氨水、甲醇和醋酸铵均为色谱纯,购自德国Merck公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 1290超高效液相色谱仪:美国安捷伦公司;TripleTOF 4600型四极杆串联飞行时间高分辨质谱仪:美国AB SCIEX公司;D 24 UV纯水仪:德国Merck Millipore公司;JXFSTPRP-24型研磨仪:上海净信科技有限公司;BSA 124 S-CW型天平:德国赛多利斯科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1样品制备
每个茶树叶片样品研磨成粉后称取50 mg,加入甲醇300μL,混匀后破碎2 min。冰水浴中超声提取5 min。在4 ℃下,13 000 r/min离心15 min,最后取200μL的上清液进样。质控样本由18份待测样本进行等量混合后制备而成。
1.3.2色谱条件
色谱柱为XSelect HSS T 3 (100×2.1 mm,2.5μm),25 ℃柱温。流动相A:0.1%甲酸水溶液,流动相B:乙腈。流速:4 mL/min,2μL进样量。洗脱梯度为:0~1 min,5%B;1~8 min,5%~95%B;8~12 min,95%B;12~20 min,95%~5%B。
1.3.3质谱条件
质谱使用正离子模式结合负离子模式,优化后的参数为:喷雾电压:负离子模式为3.1 kV,正离子模式为3.8 kV;毛细管温度320 ℃;鞘气流速45 PSI;辅助气流速15 PSI;扫描范围70~1 000 m/z;扫描速率7 Hz。
1.3.4数据处理与分析
应用安捷伦分析软件Masshunter Qualitative Analysis将原始数据转换为通用格式(mz.data)。基于R语言平台,利用XCMS程序对质谱峰进自动积分和归一化等处理,获得一个包含峰面积,m/z-RT对和样品名的可视化矩阵。使用SIMCA-P软件对可视化矩阵进行主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal least squares discriminant analysis, OPLS-DA),以检测差异代谢物[12]。基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 数据库和MetaboAnalyst软件对差异代谢物进行通路分析[13]。利用MeV 4.9软件进行热图分析。
2 结果与分析
2.1 UPLC-QTOF-MS鉴定结果
本研究基于UPLC-QTOF-MS技术分析了都匀毛尖茶大叶种和小叶种的代谢差异,结果在正离子模式下与数据库匹配到的代谢物有121个,负离子模式下匹配到的代谢物有308个。由于在负离子模式下匹配到的代谢物完全覆盖正离子模式,且在多元统计分析中负离子模式检测到的参数更有预测性和更可信,所以本研究后续的统计分析采用负离子模式下获得的数据。图1为茶树样品在质谱ESI-模式下检测到的基峰图。从图1可以看出,在0.4~0.96 min、2.7~3.7 min和7.94~10.95 min时物质相对丰度最高。
图1 样品负离子模式下基峰图(BPC)
2.2 多元统计分析
将负离子模式下获得的数据进行PCA和OPLS-DA统计分析,结果BS和GS样品呈现出明显的分离趋势(图2 A,B)。在PCA得分图中,主成分1和主成分2的贡献率分别为61.8%和21.9%,样品累计贡献率超过85%,说明代表性较好。此外,PCA分析也能反映代谢物相对丰度的分布情况,距离越近的样品物质含量差异越小,反之则越大。主成分分析中,BS样品主要分布在主成分1的正轴位置,而GS种样品主要分布在主成分1的负轴位置,并且不同品种间的样本距离较远,这表明这两个茶树品种代谢物差异较大。OPLS-DA得分图中,各品种的样本划分明确,没有分散,模型验证后参数值R2x为85.3%,R2y为99.8%,Q2为96.8%,参数值均接近1,说明负离子模型下具有较好的预测性和可靠性。此外,通过CV-ANOVA对OPLS-DA模型进行验证,R2和Q2分别为0.906和-0.385,这证明了该模型的有效性(图2 C)。
图2 多元统计分析(三角形代表GS,圆形代表BS): (A) PCA得分图 (B) OPLS-DA得分图 (C) OPLS-DA模型排序检验 (D) OPLS-DA载荷图
2.3 差异代谢物和代谢通路分析
OPLS-DA载荷图可以直观地显示不同品种样本间的差异代谢物,其中的圆点代表数据库中匹配的物质,距离横纵坐标原点越远,在边缘越分散的即为检测到的样本间显著差异代谢物。本研究对鉴定到的308个代谢物进行差异性筛选,标准为VIP≥1、p<0.05和FC≥2或FC≤-2。结果共筛选到7个显著差异代谢物,OPLS-DA载荷图见图2 D,其中包括4种黄酮醇类物质(1~4号)、2种儿茶素(5~6号)和1种酚酸类物质(7号)(表1)。
表1 不同茶树品种的差异代谢物
根据7种差异代谢物的相对丰度进行热图分析(图3),红色表明代谢物相对丰度高于平均水平,蓝色表明代谢物相对丰度低于平均水平。结果显示,BS样品中含有的杨梅素、二氢槲皮素、槲皮素、山奈酚和咖啡酰奎尼酸要明显高于GS样品;而表儿茶素和表没食子儿茶素的含量GS样品要高于BS样品。
图3 差异代谢物热图
另外,利用KEGG数据库对7个差异代谢物进行代谢通路分析(图4),结果显示,这些差异代谢物主要分布于类黄酮代谢途径中。从图中可以看出,上游代谢物二氢槲皮素和二氢杨梅素是类黄酮代谢的中间产物,在儿茶素的生物合成中起关键作用[7]。
图4 7个差异代谢物的代谢通路分析(加粗的为差异代谢物,柱状图代表物质相对丰度)
3 讨论与结论
茶树鲜叶是茶叶加工的原材料,不同品种茶树叶片含有的物质差异较大,选择合适的茶树品种对于茶叶的加工和品质至关重要。另外,茶叶中化合物成分含量的不同赋予了茶叶不同的感官品质。例如涩味主要来源于儿茶素和黄酮醇等。以往的研究表明,绿茶含有比其他茶类相对较高的儿茶素[14]。
利用UPLC-QTOF-MS技术并结合多元统计方法检测到7个显著差异代谢物,主要分布在类黄酮生物合成途径中。而类黄酮物质对于茶汤苦味的贡献较大,茶中含有许多类黄酮,约占干重的25%[15]。通常,一杯3 g左右的干茶含有约0.12 g类黄酮。茶叶的质量高度依赖于这些类黄酮化合物的含量及其性质。同时,类黄酮物质的变化也会较大程度的影响茶叶的颜色和香气等特性。基于此,新鲜茶树叶片中类黄酮物质的含量差异直接影响茶叶的加工方法及其品质。
儿茶素对茶的质量至关重要,其含量决定茶的颜色,香气和口味[16]。通常,绿茶的质量与儿茶素含量成正比,好的绿茶中含有更多的儿茶素[17]。本研究检测到的7个显著差异代谢物包括2种儿茶素,分别为表儿茶素和表没食子儿茶素,它们在GS样品中的含量远高于BS样品,这表明GS样品更适合用于绿茶加工。相反,BS样品含有的杨梅素、二氢槲皮素、槲皮素、山奈酚和咖啡酰奎尼酸的含量高于GS样品,而在中国云南、印度和斯里兰卡等地的优质红茶中,这5种代谢物的含量也较高[18],鉴于此,认为BS样品更适合加工成红茶。本研究结果可为都匀毛尖茶的加工方法和良种选育提供理论依据。