甘草甜素对小鼠矽肺纤维化的干预作用

张 静，郭一铭，李恩红，赵萌萌，贾佳佳，郝小惠,2，郭灵丽,2，刘和亮,2

矽肺是由于劳动者在生产环境中长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘引起的以矽结节形成和弥漫性纤维化为主要病理改变的一种职业性疾病。目前矽肺尚无有效的治疗方法。甘草甜素作为甘草中的重要活性成分，在抗炎、抗肿瘤以及免疫调节等方面发挥重要作用，可以减少炎症因子的释放，对实验性肝纤维化[1]、肾纤维化[2]以及特发性肺纤维化[3]等纤维化疾病具有治疗作用，但有关甘草甜素在矽肺纤维化中的作用尚不明确。该研究构建小鼠矽肺模型并给予甘草甜素干预，通过肺功能检测、组织病理学观察以及分子生物学等手段，探究甘草甜素在小鼠矽肺纤维化中的作用，为矽肺的预防及治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体级C57BL/6雄性小鼠18只(北京维通利华实验动物技术有限公司)，6～8周龄，体质量20～25 g。饲养条件：温度23 ℃，相对湿度45%～50%，昼夜替换12 h，自主饮水及进食。适应性喂养1周后用于实验。该研究经华北理工大学实验动物伦理委员会审查批准(批号：2016037)。

1.2 仪器和试剂FinePointe WBP全身体积描记系统购自美国Buxco公司；多功能酶标仪购自美国Molecular Device公司；实时荧光定量PCR仪购自美国赛默飞公司；二氧化硅购自美国Sigma公司；甘草甜素购自美国Selleck生物科技有限公司；水合氯醛购自天津市大茂化学试剂厂；甲醛溶液购自天津市津东天正精细化学试剂厂；伊红、苏木精染液购自珠海贝索生物技术有限公司；0.05%天狼星红饱和苦味酸染色液购自河北瑞帕特生物科技有限公司；羟脯胺酸含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TRIzol购自美国AB & Invitrogen公司；逆转录、荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成；转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 动物分组与处理采用随机数字表法将小鼠分为对照组、矽肺模型组以及甘草甜素治疗组，6只/组。采用滴鼻法进行造模，连续4 d向矽肺模型组和甘草甜素治疗组小鼠鼻腔中滴注0.05 ml 二氧化硅悬液(100 mg/ml)。自造模前一天起每天给予甘草甜素腹腔注射[剂量为50 mg/(kg·d)]，而对照组和模型组小鼠给予腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液。造模后第28天使用FinePointe WBP全身体积描记系统对小鼠肺功能进行测量，于次日将其处死。

1.4 小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中总细胞计数腹腔注射体积分数为4%的水合氯醛溶液(100 g/ml)麻醉小鼠，采用颈椎脱臼法处死小鼠，将其固定于操作板上。在小鼠颈部正中位置切开1 cm的小口，钝性分离组织并暴露气管，给予气管插管。使用止血钳夹住右侧肺叶，对小鼠左肺进行PBS溶液灌洗0.5 ml×3次。收集BALF于1.5 ml离心管中，在4 ℃ 1 000 r/min条件下离心6 min，吸出上清液分装冻存于-80 ℃，随后向细胞沉淀加入0.1 ml PBS溶液进行重悬，在显微镜下对细胞悬液进行细胞计数。

1.5 小鼠肺组织病理学检查使用体积分数为10%的甲醛溶液固定小鼠肺组织标本24 h，经常规脱水、石蜡包埋、切片分别进行HE染色和天狼星红染色，最后于光学显微镜下观察。

1.6 小鼠肺组织羟脯氨酸含量的测定准确称取30 mg肺组织，冰上剪碎，向其中加入1 ml水解液，混匀。在95 ℃条件下水浴20 min，使用双蒸水定容至10 ml。吸取4 ml稀释的水解液向其中加入适量活性炭，在3 500 r/min条件下离心10 min。最后吸取1 ml上清液在550 nm条件下测量各孔的吸光度值。按照说明书中提供的公式进行计算，得到小鼠肺组织羟脯氨酸的含量。

1.7 小鼠肺组织中单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、纤连蛋白(fibronectin，FN)和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMΑ)mRNA的测定使用TRIzol法提取小鼠肺组织总RNA，测定RNA浓度及纯度后根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，最后根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行检测。采用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System进行扩增。扩增条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共42个循环。选取GAPDH作为内参基因，按照2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。引物名称及序列表见表1。

表1 引物名称及序列

1.8 小鼠BALF中TGF-β1含量的测定根据小鼠TGF-β1 ELISA试剂盒说明书进行操作并使用酶标仪在波长450 nm条件下测量各孔的吸光度值。按照说明书中提供的公式进行计算，得出各组小鼠BALF中TGF-β1的水平。

2 结果

2.1 HE染色结果对照组小鼠肺组织结构正常，肺泡结构完整，无炎性细胞的聚集。与对照组相比，矽肺模型组小鼠肺组织结构破坏，肺泡间隔断裂，肺泡壁增厚，出现大量炎性细胞聚集并伴有纤维化样改变。而甘草甜素治疗组小鼠肺组织较矽肺模型组病变程度较轻。见图1。

图1 小鼠肺组织HE染色结果 ×200A：对照组；B：矽肺模型组；C：甘草甜素治疗组

2.2 天狼星红染色结果对照组小鼠肺组织中肺泡结构完整，间质未见胶原沉积，而矽肺模型组小鼠肺组织胶原分布明显增多。与矽肺模型组相比，甘草甜素治疗组小鼠肺间质胶原沉积明显减少。见图2。

图2 各组小鼠肺组织天狼星红染色 ×200A：对照组；B：矽肺模型组；C：甘草甜素治疗组

2.3 小鼠肺功能检测结果与对照组相比，矽肺模型组小鼠呼吸暂停(pause, PAU)和气道狭窄指数(enhanced pause，Penh)显著升高。与矽肺模型组相比，甘草甜素治疗组小鼠的PAU和Penh显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肺功能检测结果

2.4 肺组织羟脯氨酸含量三组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量差异有统计学意义(F=13.310，P<0.05)。与对照组相比，矽肺模型组小鼠肺组织羟脯氨酸含量显著增加。而与矽肺模型组相比，甘草甜素治疗组小鼠羟脯氨酸含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3A。

2.5 肺组织MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表达三组小鼠肺组织中MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表达差异有统计学意义(F=5.282，P<0.05；F=18.047，P<0.05；F=15.916，P<0.05)。其中，矽肺模型组小鼠肺组织中MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表达高于对照组；甘草甜素治疗组小鼠肺组织中MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表达低于矽肺模型组，差异均有统计学意义。见图3B。

图3 甘草甜素对小鼠肺组织羟脯氨酸含量及MCP-1、FN和α-SMA mRNA表达的影响A：各组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量；B：各组小鼠肺组织MCP-1、FN和α-SMA mRNA的表达；与对照组比较：*P<0.05；与矽肺模型组比较：#P<0.05

2.6 小鼠BALF中总细胞数和TGF-β1的含量矽肺模型组小鼠BALF中总细胞数高于对照组，而甘草甜素治疗组小鼠BALF中总细胞数低于矽肺模型组。此外，矽肺模型组小鼠BALF中TGF-β1含量高于对照组，而甘草甜素治疗组小鼠BALF中TGF-β1含量低于矽肺模型组，且差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠BALF中总细胞数和TGF-β1含量

3 讨论

矽肺病是我国最常见、最严重的职业病之一[4]，严重者可导致肺组织结构的破坏甚至导致患者肺功能的损害[5]。甘草甜素是甘草酸及其盐类的统称，是一种具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤作用的天然活性物质。该研究表明甘草甜素可以减少矽肺小鼠肺组织的炎症水平，降低纤维化程度，改善矽肺小鼠的肺功能。

当二氧化硅粉尘经呼吸道进入肺部，将会被巨噬细胞吞噬，刺激机体引发炎性级联反应。其中MCP-1作为一种趋化因子，可以激活单核巨噬细胞促进细胞因子的产生，参与炎症反应[6]。当肺组织反复受到刺激时，成纤维细胞会异常增殖并伴有胶原纤维的合成，进而促进纤维化病灶的产生。FN和α-SMA是纤维化过程中两个关键蛋白，它们参与细胞外基质的合成[7-9]。该研究通过实时荧光定量PCR分别检测MCP-1、FN和α-SMA mRNA水平，结果显示模型组小鼠肺组织中MCP-1、FN和α-SMA mRNA表达高于对照组，经甘草甜素治疗后降低。提示甘草甜素具有一定的抗矽肺纤维化作用。

TGF-β1是一个经典的促纤维化因子，可以促进细胞的增殖、分化、迁移，参与免疫调节，诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化[10]，促进组织修复和纤维化的生成[11]。有研究[12-13]显示，矽肺患者血清和BALF中TGF-β1的表达升高，抑制TGF-β1可以抑制矽肺的发展。研究[3]表明，甘草甜素可以抑制博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中TGF-β1/Smad2/3信号通路的活性。

综上所述，小鼠在经甘草甜素治疗后，BALF中TGF-β1的表达显著降低。提示甘草甜素可能通过作用TGF-β1相关信号通路参与调节矽肺纤维化,但其机制尚待进一步研究。