新疆维吾尔族T2DM患者外周血circRNA差异表达初步研究

仝梦维，常向云

糖尿病(diabetes mellitus， DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。根据国际糖尿病联盟(international diabetes federation，IDF)报告显示全球DM患病人数逐年升高；其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus ，T2DM)患者约占90%[1]。T2DM长期可累积损害心、脑、肾等器官，严重影响患者的生活质量。近年研究提示一不具有5′端帽子和3′端多聚A尾的非编码RNA，由外显子、内含子或者外显子和内含子共同构成[2]，并且大量存在[3]。环状RNA(circular RNA，circRNA)具有组织特异性及发育特异性、进化保守性、较高的抗外切酶或核糖核酸酶降解的特点[4-5]，这些特性可更好地辅助研究疾病的发生机制及提高有关疾病的预防和诊疗水平。多项研究[6-8]表明，circRNA参与了糖尿病及其并发症的发生发展过程。多次流行病学调查显示新疆地区维吾尔族T2DM的患病率远高于同地区其他民族，并且其并发症检出率也较高[9]。该研究通过高通量核苷酸测序技术筛选出维吾尔族T2DM患者差异表达的circRNAs，选取其中4条，经扩大人群样本量观察其在外周血中的表达情况，探讨这些circRNAs在维吾尔族T2DM分子生物学发病机制方面的意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象入组样本来自石河子大学医学院第一附属医院2019年10月—2020年6月门诊体检者及住院患者的外周静脉血。该研究经石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会批准(批号：2018-028-01)；并征得所有研究对象的知情同意，进入研究之前均签署知情同意书。所有入组人员均接受过75 g口服葡萄糖耐量试验(OGTT试验)。T2DM诊断均符合1999年WHO的糖尿病诊断标准[10]，余纳入标准：① 长期居住新疆，三代内未与其他民族通婚的维吾尔族；② 无自身免疫性疾病，无严重的心、肝、肾脏疾病，无恶性肿瘤，非妊娠、哺乳期妇女；③ 年龄均大于40岁。最初的“高通量核苷酸测序队列”由5例明确诊断的维吾尔族T2DM患者和5例维吾尔族正常对照者(NC组)组成，而验证队列由22例明确诊断为T2DM患者和20例NC组成。其中，T2DM组平均年龄(62.10±11.23)岁，男9例，女13例；NC组平均年龄(56.95±9.72)岁， 男9例，女11例。见表1。

表1 入组对象基本信息

1.2 单核细胞提取入组的研究对象均要求夜00：00以后禁食，以确保空腹8 h以上，于次日晨抽取外周静脉血5 ml，置于EDTA抗凝管中；根据外周血单核细胞提取试剂盒(TBD公司，天津)说明将试剂与外周血形成浓度梯度后置于水平离心机中以2 500 r/min离心20 min，收集离心后的单核细胞，加入TRIzol，-80 ℃冰箱保存。

1.3 总RNA的提取以及质量和完整性检测按照TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书，提取外周血单核细胞的总RNA；用紫外分光光度仪(Nanodrop ND-2000，美国Thermo公司)测定总RNA的浓度和纯度，要求A260/A280在1.8 ～2.0之间；用变性琼脂糖凝胶电泳法测定总RNA的完整性。见图1。

图1 RNA电泳图

1.4 差异环状RNA筛选采用Findcirc(武汉生命之美科技有限公司)进行转录组高通量测序，预测出来的circRNA中满足长度大于10 000 bp，且back spliced reads数目大于2的进行基因组定位分析。通过样本聚类关系判断测序实验设计及样本取材的正确性，表达值由颜色刻度表示，强度从蓝色(相关系数越低)增至红色(相关系数越高)；如样本相似性越高，相似系数越大，聚类分析热图越接近红色，样本类聚关系越近。见图2。根据各样本中的circRNA表达情况进行两样本间的相关性分析，以此来检查不同样品之间的circRNA表达水平的相关性。采用edgeR软件进行数据标准化和差异性表达的circRNA筛选，当表达变化倍数(fold change，FC)≥2.0或≤0.5，P<0.05时表示有显著差异性，通过MA Plot(纵坐标表示以10为底取log值的表达量变化差异的统计学显著性(以10为底取log值)，横坐标表示以2为底取log值表达量变化倍数(以2为底取log值)。上调circRNAs位于上方的蓝色线条(M value=1,FC=2)以上部分，下调circRNAs位于下方的蓝色线条(M value=1,FC=0.5)以下部分。分层聚类分析产生热图[每一列表示一个组织样本，每一行表示1个circRNA，表达值由颜色刻度表示，强度从蓝色(相对低表达)增至红色(相对高表达)]，以显示NC和T2DM外周血之间的表达上调和下调的circRNAs。

图2 样本聚类图

1.5 反转录及RT-qPCR采用Thermo(美国)反转录试剂盒：20 μl反应液体系：Templet RNA 8 μl，Oligo(dT) primer 1 μl， 5×Reaction Buffer 4 μl, RiboLock RNnase Inhibitor 1 μl，10 mmol/L Dntp Mix 2 μl，RevertAid M-MuLV RT(200 U/μl) 1 μl， RNase-free water 2 μl；反转录合成第一链cDNA，条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。circRNAs双向引物由引物设计软件Blast设计，交由上海吉玛合成。RT-qPCR采用的QuantiNova SYBR-Green PCR Kit(500)，20 μl反应液体系(德国 Qiagen GmbH)：2×SYBR-Green PCR Master Mix 10 μl，QN ROX Reference Dye 0.5 μl，CircRNA引物1 μl， 第一链cDNA 2 μl， RNase-free water 6.5 μl。在实时定量PCR仪(美国应用生物系统公司7500 Fast Real-Ttime PCR System)上进行扩增，反应条件为:95 ℃、5 min，40个PCR循环[95 ℃、10 s，60 ℃、30 s(收集荧光)]，为建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，从60 ℃缓慢加热至99 ℃(仪器自动进行Ramp Rate为0.05 ℃/s)。反应结束由系统自动计算各反应管Ct值，采用2-ΔΔCt法进行相对定量。所有样本定量PCR反应均为1式3孔。PCR扩增曲线基线平滑，指数扩增期明显，直到平台期，副孔之间平行性较好，说明PCR扩增良好；熔解曲线为单峰，无杂峰，说明扩增产物具有特异性，无其他非特异性产物存在。见表2。

表2 用于分析circRNA 水平的RT-qPCR 引物

2 结果

2.1 高通量核苷酸测序结果本次高通量核苷酸测序共发现134个差异表达的circRNAs，其中87个表达上调，47个表达下调，见图3。这些差异表达的circRNAs大多数由外显子构成，见图4；并且分布于各个染色体，包括X染色体，见图5。通过MA Plot过滤，最终确定两组间差异有统计学意义的circRNAs，见图6，并根据以下两个基本参数(FC≥2或≤0.5，P<0. 05)选定目标circRNAs进行qRT-PCR实验；经筛选和比对挑选出符合标准的4个circRNAs，其中表达上调：hsa-circ-0139634(FC=3.365，P=0.009)，has-circ-0005414(FC=3.343，P=0.006)；表达下调：hsa-circ-0032491(FC=3.456，P=0.044)，hsa-circ-0002922(FC=3.690，P=0.013)。见表3。

图3 NC和T2DM外周血微阵列分析热图

图4 根据基因组起源对显著失调的circRNAs 进行分类

图5 染色体中环状RNA分布

表3 四个显著失调的circRNAs

图6 NC与T2DM的外周血circRNAs的差异表达的MA plot

2.2 RT-qPCR验证候选circRNA及ROC曲线分析本研究选取T2DM患者(n=22)及NC人外周血(n=20)进一步验证。通过RT-qPCR技术实时绘制熔解曲线及扩增曲线，最终结果显示，扩增曲线基线平滑且熔解曲线为单峰，其中hsa-circ-0139634(P<0.001)、hsa-circ-0032491(P=0.029)及has-circ-0002922(P=0.040)在2组人群中差异表达具有统计学意义，与测序结果一致；has-circ-0005414(P=0.910)在2组人群中的差异表达未得到验证，见表4。分别对4个circRNAs进行ROC曲线分析显示，hsa-circ-0139634的ROC曲线下面积是0.926[95%CI(0.839～1.000)，P<0.001], 约登指数为0.833，敏感性为1.000，特异性为0.833，截断值为0.169；has-circ-0005414的ROC曲线下面积是0.575[95%CI(0.370～0.779)，P=0.910], 约登指数为0.278，敏感性为0.412，特异性为0.867，截断值为5.749；hsa-circ-0032491的ROC曲线下面积是0.316[95%CI(0.086～0.440)，P=0.017]， 约登指数为0.056，敏感性为1.000，特异性为0.056，截断值为0.230；hsa-circ-0002922的ROC曲线下面积是0.263[95%CI(0.078～0.428)，P=0.014]， 约登指数为0.080，敏感性为0.955，特异性为0.125，截断值为0.011，见图7。

表4 两组间RT-qPCR验证的基因情况[M(P25，P75)]

图7 所选定的4条circRNA的ROC曲线A：has-circ-0005414基因；B：hsa-circ-0139634基因；C：has-circ-0032491基因；D：has-circ-0002922基因

3 讨论

T2DM在全球是一个比较普遍的代谢性疾病，其发病机制尚不清楚，仅知其由环境因素和遗传因素联合作用所致。维吾尔族是T2DM的高发病率人群，该研究为首次探索新疆维吾尔族T2DM患者外周血中circRNAs的差异表达谱及其在维吾尔族T2DM分子生物学发病机制方面的意义。该研究运用高通量核苷酸测序技术对维吾尔族5例T2DM者和5例NC的志愿者样本进行了测序，获得了两组间circRNAs差异表达谱，差异表达的circRNAs分布于各个染色体上；通过MA plot过滤发现这些差异表达circRNAs中的大部分在维吾尔族T2DM组中是上调表达的，其中外显子占比为86%。根据基因hsa-circ-0139634、has-circ-0005414、hsa-circ-0032491及has-circ-0002922的序列设计出用于RT-qPCR验证的双向引物，通过42例样本检测了4个circRNAs的表达量，结果显示hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922在两组人群中的差异表达具有统计学意义。查阅近几年关于circRNAs与DM发生有关的国内外文章，未见关于hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922与DM相关联的报道。本次实验是首次提出hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922在维吾尔族T2DM患者与NC人群中的表达量存在差异性。通过对hsa-circ-0139634、hsa-circ-0032491、has-circ-0002922进行ROC曲线下面积分析，显示hsa-circ-0139634的曲线下面积最大，且其灵敏度、特异性及正确指数均较高，推测其在维吾尔族T2DM分子生物学发病机制方面具有潜在价值，可能成为区分维吾尔族T2DM患者与NC人群的新型分子标志物。

目前研究者[11]认为circRNAs主要通过以下四种方式发挥作用：① 作为micro RNA(miRNA)海绵，通过吸附miRNAs抑制其翻译功能；② 少部分circRNAs可作为翻译模板，翻译出对应蛋白质；③ 与蛋白质相结合并抑制蛋白质的作用；④ 可调节亲本基因参与转录，其中以作为miRNA海绵的作用最为重要，这是一种通过内源性竞争作用来调节miRNA靶基因的转录。如环状RNA CIRS-7/CDR1as能够通过阻断miR-7及其下游通路，调节胰岛细胞胰岛素的转录和分泌；环状RNA circHIPK3可通过隔离miR-124-3p和miR-338-3p以及调节β细胞关键基因如Slc2a2、Akt1和Mtpn的表达而干扰胰岛细胞的功能[12]。因此，推测此次测序发现的差异表达的circRNAs可能是通过miRNA海绵作用对下游靶基因产生调节，从而影响维吾尔族T2DM的发生发展。

目前研究还没有确凿的证据证明hsa-circ-0139634的功能；因此，hsa-circ-0139634与miRNA的相互作用机制将是后期深入研究的内容。该研究是单一中心的研究，受试者在地理上高度集中，尚不清楚其他地区和民族是否也有类似的circRNAs表达谱，因此该研究结果需要在更多样化的队列中进一步验证；并且该研究为小样本研究，未在大样本中进一步验证，因此课题组将在后期研究中对该研究的circRNAs进行大样本验证及对应通路预测和验证。该研究为探索维吾尔族T2DM的分子生物学发病机制打下了前期基础，为维吾尔族T2DM患者的诊疗带来新思路。