马波沙星注射液无菌检查方法的建立

赵富华，于晓辉，杨 星，龚旭昊，马秋冉，董玲玲

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

马波沙星作为第三代喹诺酮类抗菌药物，具有抗菌谱广，消除半衰期长，生物利用度高的特点，在兽药市场具有良好的发展前景，国内企业自2014年起陆续申报马波沙星及其制剂，拟在《中国兽药典》2020年版中制定马波沙星及制剂的质量标准。为控制产品质量，需对马波沙星注射液进行无菌检查方法的研究[1-2]。马波沙星具有抑菌作用，所以拟采用薄膜过滤法对马波沙星注射液的无菌检查进行方法学研究[3-5]。

1 材料与仪器

1.1 样品 马波沙星注射液(河北远征药业有限公司生产，规格：100 mL:10 g，批号为16B180301、16B180302、16B180303)。

1.2 稀释剂及培养基 0.1%无菌蛋白胨水溶液、硫乙醇酸盐流体培养基(批号20180710)、胰酪大豆胨液体培养基(批号20180710)、胰酪大豆胨琼脂培养基(批号20180710)、沙氏葡萄糖液体培养基(批号20180710)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号20180710)，均由北京中海生物科技有限公司提供。

1.3 菌种 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均购自中国药品生物制品检定研究院。

1.4 试验仪器 HTY-1650AG3型无菌隔离器(浙江泰林生物技术股份有限公司)、无菌试验集菌培养器(浙江泰林生物技术股份有限公司，型号：EVS3，批号：20170812)、生物安全柜(美国Nuaire公司)、SPX-250B-Z型生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、GI7-2型恒温培养箱(美国Shellab公司)。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备 分别取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物1白金耳，接种于10 mL胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35 ℃培养18～24 h，取1 mL分别加入9 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，作为10-1管，逐管10倍稀释至小于100 cfu/mL，活菌计数备用。

取生孢梭菌的新鲜培养物1白金耳，接种于10 mL硫乙醇酸盐流体培养基中，经30～35 ℃培养18～24 h，取1 mL加入9 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，作为10-1管，逐管10倍稀释至小于100 cfu/mL，活菌计数备用。

取白色念珠菌的新鲜培养物1白金耳，接种于10 mL沙氏葡萄糖液体培养基中，经20～25 ℃培养24～48 h，取1 mL加入9 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，作为10-1管，逐管10倍稀释至小于100 cfu/mL，活菌计数备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25 ℃培养5～7 d，加入3～5 mL含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，取1 mL加入9 mL 含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，作为10-1管，逐管10倍稀释至小于100 cfu/mL，活菌计数备用。

2. 2 活菌计数 分别取上述细菌菌液1 mL加入培养皿，每种菌液做2个平皿，注入胰酪大豆胨琼脂培养基约18 mL，置30～35 ℃培养24～48 h。取生孢梭菌菌液1 mL，置于200 mL硫乙醇酸盐流体培养基中，置30～35 ℃培养24～48 h。分别取上述真菌菌液1 mL加入培养皿，每种菌液做2个平皿，注入沙氏葡萄糖琼脂培养基约18 mL，置20～25 ℃培养48～72 h。计数结果见表1。

表1 活菌计数结果

2. 3 培养基的灵敏度检查 取每管装量为12 mL的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3 d。另取每管装量为9 mL的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100 cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5 d。以空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管生长良好来判定该培养基的灵敏度检查符合规定。试验结果见表2。

表2 培养基灵敏度检查结果

经检查，空白对照管均无菌生长，加菌培养基生长良好，该培养基的灵敏度检查符合规定。

2.4 无菌检查方法适用性试验(薄膜过滤法)

2.4.1 供试品阳性菌试验组 取供试品10支，每支取20 mL，用封闭式薄膜过滤器过滤后，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜，每膜每次100 mL，冲洗6次，在最后一次冲洗液中分别加入小于100 cfu/mL的菌液1 mL，过滤后，每个滤筒内灌注培养基，其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌在硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35 ℃条件下培养5 d，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉在胰酪大豆胨液体培养基中，20～25 ℃条件下培养5 d，各2组。

2.4.2 阳性菌对照组 取封闭式滤筒，其中三滤筒加入硫乙醇酸盐流体培养基，分别接种小于100 cfu/mL的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各1 mL，30～35 ℃条件下培养5 d；另三筒加入胰酪大豆胨液体培养基，分别接种小于100 cfu/mL的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉1 mL，20～25 ℃条件下培养5 d。

2.4.3 供试品阴性组 取供试品10支，每支取20 mL，用封闭式薄膜过滤器过滤后，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜，每膜每次100 mL，冲洗6次，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基，置规定温度下培养5 d。

2.4.4 阴性对照组 取封闭式滤筒2个，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗，冲洗次数与冲洗量与试验组相同，向滤筒中分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基，置规定温度下培养5 d。

2.4.5 方法适用性试验结果 结果表明(表3、表4)，本品采用薄膜过滤后，含供试品的阳性菌试验组冲洗6次时试验菌均生长良好，表明冲洗6次后，供试品对细菌生长没有影响。

表3 供试品阳性菌试验组与阳性菌对照组试验结果

表4 供试品阴性组与阴性对照组试验结果

2.4.6 供试品无菌检查 取三批供试品，按照验证过的无菌检验方法进行检查。结果显示，阳性对照菌在24 h内生长良好，阴性对照14 d内均澄清，无菌生长，供试品14 d内均澄清，无菌生长，无菌检查结果符合规定。

3 讨论与结论

本试验依据《中国兽药典》2015年版一部附录1101无菌检查法方法适用性试验的要求[6](亦符合《中国兽药典》2020年版一部附录1101的要求)，对马波沙星注射液无菌检查方法进行验证，因马波沙星具有抑菌作用，故采用薄膜过滤法，考察冲洗次数，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜，每膜每次100 mL，冲洗3、4、5次，结果冲洗3、4、5次时，除白色念珠菌和黑曲霉供试品阳性生长外，其他供试品阳性菌均无菌生长，说明冲洗5次时供试品还有抑菌作用，根据预实验结果，确定冲洗6次，结果与阳性菌对照组相比，供试品阳性菌试验组生长情况均良好，说明该条件下能够有效清除药物自身的抑菌活性且不影响试验菌的生长，而供试品阴性对照组与阴性对照组中均无细菌生长，说明前处理及操作过程中不会引入其他细菌的污染。最终确立检查方法为：取本品，经薄膜过滤法处理，依法检查(附录1101)，应符合规定。具体操作步骤：供试品取10支，每支取20 mL，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜，每膜每次100 mL，冲洗6次，该方法科学、可靠，在该无菌检查条件下可去除药物的抑菌干扰。

薄膜过滤法可用于马波沙星注射液的无菌检查。在做马波沙星注射液无菌检查时，一定要注意冲洗次数，否则易致试验失败(供试品阳性菌不生长)。