双葛止泻口服液抑菌剂用量筛选与抑菌效力研究

李焕娟，桑卡娜，周 冰，杨绒娟，潘贵珍，周德刚

(洛阳惠中兽药有限公司，国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳 471003)

双葛止泻口服液由金银花、葛根等经提取、浓缩、纯化及制剂成型而成的中药口服溶液，功能清热燥湿，解毒止泻，用于仔猪湿热泄泻，实验室研究其具有止泻、抗炎的作用。在兽药生产、贮藏和使用过程中，为防止双葛止泻口服液中微生物生长繁殖，需要加入适宜的抑菌剂用以增加抑菌作用。抑菌剂是指抑制微生物生长的化学物质，有时也称防腐剂[1]。在口服制剂中，苯甲酸钠因其对酵母、霉菌和部分细菌都有较好的抑制作用而被广泛应用[2-3]，其用量范围一般为0.1%～0.5%[4]。由于抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量[1]。

抑菌剂的抑菌有效性主要是通过抑菌效力检查法进行测定的。抑菌效力检查是对供试品中微生物的存活情况的动态监测过程。既要研究供试品被微生物污染后在短时间内抑菌剂对大量入侵微生物的抑制或杀灭的情况，又要研究随着时间的推移微生物对周围环境产生耐受或抑菌剂的稳定性发生改变后，供试品中微生物的总量是否仍能够被控制在合理范围内。

本研究依据《中国兽药典》2015年版一部附录“1121抑菌效力检查法”的要求，对双葛止泻口服液中的抑菌剂用量进行筛选，用以确定抑菌剂的最低有效用量。参考《中国兽药典》2015年版二部附录“1102非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”和附录“1104非无菌兽药微生物限度标准”进行微生物计数方法适用性研究，确定供试品合适的微生物计数方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器 YP10002型电子天平，金诺天平仪器有限公司；YXQ-LS-100A型全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；电热恒温水浴锅，型号SSW-420-2S，上海博讯实业有限公司；电热恒温培养箱，型号DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司；双人超净工作台，型号SW-CJ-2FD，上海博讯实业有限公司；集菌仪，型号HTY-602，浙江泰林生物技术股份有限公司；微量移液器，规格100 μL、1000 μL、5 mL，德国Eppendorf公司；

1.1.2 培养基及稀释液 胰酪大豆蛋白胨液体培养基，批号20170116；胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基，批号20161018；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号20160924；沙氏葡萄糖液体培养基，批号20160224；pH值7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液，批号20160321；均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。培养基适用性检查符合《中国兽药典》2015年版要求。

1.1.3 菌种 金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26003〕、铜绿假单胞菌〔CMCC(B) 10104〕、大肠埃希菌〔CMCC(B) 44102〕、白色念珠菌〔CMCC(F) 98001〕、黑曲霉菌〔CMCC(F) 98003〕，购自中国食品药品检定研究院医学菌种保藏中心。

1.1.4 试药 双葛止泻口服液，规格：每1 mL相当于原生药0.45 g，250 mL/瓶。按照双葛止泻口服液制备工艺制备苯甲酸钠含量分别为0.1%、0.2%、0.3%和0.5%的样品。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液的制备 取经35 ℃培养24 h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及大肠埃希菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培养物适量，另取经25 ℃培养48 h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面培养物适量，加入适量的无菌0.9%氯化钠溶液，制成含菌数约为107～108CFU/mL的菌悬液(用于抑菌效力检查)。取上述菌悬液用无菌0.9%氯化钠溶液稀释成含菌数约为50～100 CFU/mL的菌悬液(用于微生物计数方法适应性研究)。取经25 ℃培养7 d的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面培养物，加入5 mL含0.05%(V∶V)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，洗下孢子，制成含孢子数约为107～108CFU/mL的孢子悬液(用于抑菌效力检查)。取上述孢子悬液用含0.05%(V∶V)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液稀释成含孢子数约为50～100 CFU/mL的孢子悬液(用于微生物计数方法适应性研究)。

1.2.2 微生物计数方法适用性研究 考虑到抑菌剂苯甲酸钠具较强的抗菌活性，因此，在细菌计数试验时应采用薄膜过滤法去除其抑菌活性；由于抑菌剂的浓度与抑菌效果成正相关，故本研究以最大添加抑菌剂0.5%苯甲酸钠的供试品进行方法适用性研究，以保证所有浓度抑菌剂供试品微生物计数方法均能符合要求。

1.2.2.1 供试液的制备 取苯甲酸钠含量为0.5%的双葛止泻口服液供试品10 mL至无菌玻璃瓶中，分别加入90 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，充分混合，制成1∶10(V∶V)的供试液。

1.2.2.2 计数方法适用性试验方法(薄膜过滤法)

分别按以下方法对5种试验菌株进行计数方法适用性试验。

试验组：用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，润湿滤膜后(水膜)，取供试液1 mL加入100 mL pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀，加入薄膜过滤器的滤筒中过滤，用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 mL，最后一次冲洗时，冲洗液中加入50～100 CFU/mL的试验菌1 mL，摇匀后，滤过滤膜。

供试品对照组：用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，润湿滤膜后(水膜)，取供试液1 mL加入100 mL pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀，加入薄膜过滤器的滤筒中过滤，用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 mL。

菌液对照组：用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，润湿滤膜后(水膜)，用100 mL pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液过滤，再用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 mL，最后一次冲洗时，冲洗液中加入50～100 CFU /mL的试验菌1 mL，摇匀后，滤过滤膜。

阴性对照组：用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，润湿滤膜后(水膜)，用pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 mL。

过滤完成后将滤膜取出，将滤膜的菌面朝上贴于琼脂平板上。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌制备的滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，35 ℃培养3 d，计数。白色念珠菌和黑曲霉平行制备2份滤膜，一份贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，35 ℃培养5 d，计数；另一份贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，25 ℃培养5 d，计数。

1.2.3 抑菌效力测定方法

1.2.3.1 供试品制备 取包装完整的苯甲酸钠含量分别为0.1%、0.2%、0.3%和0.5%的双葛止泻口服液供试品各10 mL至无菌玻璃瓶中，分别加入90 mL pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，充分混合，制成1∶10(V∶V)的供试液。

1.2.3.2 供试品接种 取“1.2.1”项下制成的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及大肠埃希菌的菌悬液(含菌数约为107～108CFU/mL)及孢子悬液(含孢子数约为107～108CFU/mL)，分别取0.1 mL试验菌于上述4份供试液中，每一容器接种一种试验菌，充分混合，使供试液中的试验菌均匀分布，置25 ℃培养箱中，避光贮存。

1.2.3.3 存活菌数测定 根据《中国兽药典》2015年版一部附录“1121抑菌效力检查法”中表2-表3的规定，在供试品接种0 h、14 d、28 d时，分别从上述每个供试品容器中取供试品1 mL，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1∶10、1∶102、1∶103等稀释级，测定每份供试品中所含的菌数。其中测定方法依据1.2.2.2方法适用性试验验证合格的方法(薄膜过滤法)进行供试品中微生物计数。

1.2.3.4 抑菌效力判断标准 内服制剂的抑菌效力判断标准见表1。表中“减少的lg值”是指各间隔时间测定的菌落lg值与1 mL供试品中接种的菌数lg值的差值。

表1 内服制剂的抑菌效力判断标准

2 结果与分析

2.1 方法适用性试验结果 根据《中国兽药典》2015年版二部要求，方法适用性检查各试验菌的回收率不得低于70%。试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值计算回收率，结果见表2。

表2 计数方法适用性试验结果

2.2 抑菌效力测定结果 抑菌效力测定结果见表3。参考内服制剂的抑菌效力判断标准，双葛止泻口服液中苯甲酸钠含量为0.1%时，对白色念珠菌的抑制作用在间隔14 d和28 d均减少了0.7 lg，未达到药典规定的至少降低1 lg的标准；双葛止泻口服液中苯甲酸钠含量为0.2%时，对白色念珠菌的抑制作用在间隔14 d和28 d均减少了0.9 lg，未达到药典规定的至少降低1 lg的标准；双葛止泻口服液中苯甲酸钠含量为0.3%和0.5%时，对细菌和真菌的抑菌效力均达到了《中国兽药典》2015年版的抑菌效力判定标准。

表3 接种后0 h细菌计数结果(CFU/mL)

表4 接种后14 d细菌计数结果(CFU/mL)

表5 接种后28 d细菌计数结果(CFU/mL)

3 讨论与结论

3.1 抑菌剂用量筛选方法选择的依据 双葛止泻口服液为非无菌制剂，在制剂中添加适宜的抑菌剂，用以防止制剂在正常贮藏或使用过程中由于微生物的生长繁殖影响药物质量。抑菌效力检査法是筛选抑菌剂用量的有效方法，可用于测定无菌及非无菌制剂的抑菌活性，用于指导研发阶段制剂中抑菌剂用量的确定[5-10]，因此本研究采用抑菌效力检查法筛选抑菌剂的用量。

3.2 抑菌剂用量筛选的重要性 抑菌剂用量的筛选非常重要，抑菌剂添加量过少，会使微生物生产繁殖从而引起污染，抑菌剂添加量过多，会引起不适或过敏等变态反应。理想的抑菌剂应作用迅速，其应在使用浓度范围内安全无毒，与制剂中其他成分和包装材料相容性良好[11-12]。由于苯甲酸钠价格便宜，被广泛用于食品、制药行业[4]，双葛止泻口服液拟用于仔猪腹泻，考虑到经济动物使用成本因素，因此选择苯甲酸钠作为双葛止泻口服液的抑菌剂。苯甲酸钠防腐作用依靠苯甲酸未解离分子，因此，pH值对其抑菌效果影响较大，双葛止泻口服液为弱酸性液体，因此选用苯甲酸钠作为防腐剂是合理的。按照《中国兽药典》2015年版一部附录“1121抑菌效力检查法”内服制剂抑菌剂效力判断标准，双葛止泻口服液中苯甲酸钠含量为0.3%和0.5%时，均能满足抑菌剂效力试验要求，但根据最小有效量添加的原则，确定双葛止泻口服液中苯甲酸钠含量为0.3%，本结果与同类中药口服液体制剂考察结果基本一致[9]。

表6 含不同用量苯甲酸钠的双葛止泻口服液样品抑菌效力检查结果

3.3 结论 综上，根据《中国兽药典》2015年版一部附录“1121抑菌效力检查法”的要求，0.3%的苯甲酸钠可作为双葛止泻口服液的抑菌剂用量。