无血清全悬浮PK15细胞培养猪圆环病毒2型的研究

刘天伦

(北京民海生物科技有限公司，北京 102609)

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)引起的病毒性传染病，给养猪业造成巨大损失。研究表明，PCV2仅在PK15等少数哺乳动物细胞上增殖，且由于PCV2感染后细胞不破裂，想要获得高病毒滴度难度较大[1]。PCV2体外培养特性适于在具有旺盛增殖能力并处于有丝分裂过程中的细胞上复制，并且PCV2的复制依赖于细胞周期S期表达的各种细胞蛋白及酶[1]。D-氨基葡萄糖一方面可以增强细胞S期蛋白的表达，另一方面可以促进病毒DNA进入细胞核，因此，D-氨基葡萄糖处理细胞可显著增强病毒的增殖能力[2]。

目前，应用PK15细胞进行PCV2的生产主要是采用转瓶和微载体工艺。转瓶存在占地空间大、劳动强度大等缺点。何锡忠等[3]利用微载体技术培养PK15细胞生产PCV2，许冬等[4]对片状载体培养PCV2也进行了工艺的研究，但微载体工艺存在价格昂贵，球状载体重复利用效果差，放大培养繁琐等劣势。驯化一株可适应大规模培养且无血清全悬浮培养PCV2的PK15细胞，势必可推进工艺的进一步升级。本研究对一株贴壁的PK15细胞进行了无血清全悬浮驯化，然后进行了驯化后细胞对PCV2敏感性试验，对接毒时间、接毒量以及收获方式进行了试验分析，以期为大规模培养PCV2提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和毒株 PK15细胞(猪圆环病毒1型阴性、猪肺炎支原体阴性)由大北农动物医学研究中心保存，PCV2(DBN-SX07)由大北农动物医学研究中心提供。

1.1.2 主要试剂和耗材 无血清悬浮培养基PK15-H(M20317)，上海源培生物有限公司；D-氨基葡萄糖(D-G)，Sigma公司；DMEM-F12(12500-096)，Gibco公司；新生牛血清(04-102-1A)，BI公司；Anti-PCV2-MAB 12c.48(圆环单克隆抗体)，韩国JBT公司；羊抗鼠荧光抗体购自美国KPL公司。细胞方瓶、摇瓶、96孔板购自美国康宁公司。

1.1.3 主要仪器和设备 CO2培养箱，Thermo公司；轨道式振荡器购自杭州奥盛仪器有限公司；倒置显微镜，Olympus公司；Countstar细胞计数仪，上海睿钰生物科技有限公司；低速冷冻离心机，美国Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 PK15细胞无血清全悬浮驯化 对一株贴壁的PK15细胞进行了无血清的全悬浮驯化，经贴壁降血清培养、低血清悬浮优化传代、无血清悬浮传代培养，累计传代23次后，该株细胞可在无血清全悬浮培养条件下，初始密度为0.5×106/mL时，经72 h密度可增殖到4.0×106/mL左右，形态良好，倍增时间稳定，且细胞活率达到95%以上，命名为PK15-S[5]。

1.2.2 PK15-S细胞对PCV2敏感性实验 参考平面PK15细胞接毒工艺，将驯化后的PK15-S细胞按0.04 MOI接毒，接毒密度为0.5×106/mL，同时加入2% D-G(V/V)，48 h、72 h收获病毒，收获后用间接免疫荧光法测定病毒滴度。

1.2.3 不同接毒时间对病毒滴度的影响 细胞初始密度0.5×106/mL，分别采用0 h接毒和24 h接毒的方式进行接毒实验的摸索，按照0.04 MOI接毒的同时加入2% D-G(V/V)，两种方法收获时间分别为病毒培养的48 h和72 h，收获后用间接免疫荧光法测定病毒滴度。

1.2.4 不同MOI对病毒滴度的影响 分别按0.02 MOI、0.04 MOI、0.1 MOI进行0 h接毒实验，接毒细胞密度0.5×106/mL，接毒的同时加入2%D-G(V/V)，收获时间均为72 h，收获后用间接免疫荧光法测定病毒滴度。

1.2.5 带毒传代连续收获产毒情况 由于感染PCV2的PK15细胞可带毒传代，所以该驯化细胞也进行带毒传代，接毒细胞密度0.5×106/mL，按照0.04 MOI接毒，同时加入2% D-G(V/V)，培养72 h后，按传代比例收获病毒并带毒继续传代的方法，连续收获三次，收获后用间接免疫荧光法测定病毒滴度。

1.2.6 病毒滴度的测定

1.2.6.1 收获液的处理 将摇瓶中收获的PCV2病毒液反复冻融3次后，1000 r/min离心5 min后取上清液待检测。

1.2.6.2 检测 在96孔培养板中每孔加入100 μL用含8%新生牛血清的DMEM-F12生长液制成的浓度为2×105/mL的PK15细胞悬液，待细胞长至24 h左右，弃掉板内培养液，把待测的PCV2病毒悬液作10倍系列稀释，稀释液为加入含2% D-G的2%新生牛血清的DMEM-F12，每个稀释度接种6个孔，每个孔100 μL；阴性对照6孔，加入制备好的细胞悬液100 μL；在37 ℃、5% CO2培养箱中培养96 h后，取出孔板，弃掉孔内培养基，在通风橱内加入200 μL 80%丙酮，放在4 ℃固定1 h后取出孔板，吸去孔内丙酮，用PBS洗涤3 次/min，加入圆环单克隆抗体(工作浓度稀释倍数)，每孔200 μL，37 ℃孵育1 h，取出用PBS洗涤3 次/min，加入羊抗鼠荧光抗体(工作浓度稀释倍数)50 μL，37 ℃避光孵育1 h，取出用PBS洗涤后镜检观察，待检样品出现绿色荧光为阳性，阴性对照无绿色荧光，按照Reed-Muench法计算病毒滴度。

2 结果与分析

2.1 PK15细胞无血清全悬浮驯化 该株贴壁PK15细胞，从复苏到最终驯化成全悬浮PK15-S细胞，经过3种培养方法的过渡(表1)，共23次传代，细胞状态良好，活率较高，可冻存保种。为了验证该驯化细胞的稳定性，本实验又将驯化后冻存细胞再次复苏，并按初始密度0.5×106/mL连续传11代，细胞长势良好，倍增时间稳定，结果见表2。

表1 训化过程中的细胞情况

表2 PK15-S细胞复苏后传代生长情况

2.2 PCV2对PK15-S细胞敏感性试验 细胞驯化完成后，需及时进行毒的敏感性试验，取复苏后传代3次的PK15-S细胞进行接毒试验，毒种滴度为105.5TCID50/mL，细胞初始密度为0.5×106/mL，0 h接毒，经过72 h的带毒培养，细胞仍可增殖至4.24×106/mL，收获时细胞活率为94.6%，取48 h、72 h收获液用间接免疫荧光法测定病毒滴度分别为104.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL，证实此PCV2对该驯化株PK15-S仍有较好的敏感性，结果见表3。

表3 PCV2对PK15-S细胞敏感性情况

2.3 不同接毒时间对病毒滴度的影响 为验证接毒的最佳时间，取两组复苏后传代三次的PK15-S细胞，初始密度都为0.5×106/mL，分别在0 h和24 h进行接毒，分别培养72 h和96 h，两组试验在48 h和72 h进行取样检测，0 h接毒组病毒滴度分别为104.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL，24 h接毒组病毒滴度分别为104TCID50/mL、104.5TCID50/mL，试验最终收获时，两组细胞都有较高的活率，分别为94.6%、97.0%。通过以上数据可以得出，该驯化株PK15-S细胞0 h接毒培养滴度优于24 h接毒培养滴度，结果见表4。

表4 接毒时间对病毒滴度的影响

2.4 不同MOI对病毒滴度的影响 三组试验按不同MOI接毒后，培养72 h，分别在48 h和72 h取样检测，0.02 MOI组病毒滴度分别为104.4TCID50/mL、105.4TCID50/mL，0.04 MOI组病毒滴度分别为104.5TCID50/mL、106.0TCID50/mL，0.1 MOI组病毒滴度分别为105.4TCID50/mL、106.4TCID50/mL。由表5可见，细胞培养至72 h后，前两组细胞密度都超过了4.0×106/mL，细胞活率都在95%左右，最后一组细胞密度和细胞活率都略低于前两组，密度为3.45×106/mL，活率为90.5%。仅就滴度而言，MOI为0.1时病毒滴度最高，可达106.4TCID50/mL。

表5 MOI对病毒滴度的影响

2.5 带毒传代连续收获产毒情况 当MOI为0.1时，72 h细胞数和细胞活率均没有MOI为0.04的理想，故连续收获按照0.04 MOI接毒，接毒时细胞密度为0.5×106/mL，培养72 h后，按传代比例收获病毒并带毒继续传代的方法，在显微镜下观察带毒传代细胞，细胞状态良好，轮廓清晰可见，结果见图1；连续收获三次，收获样品用间接免疫荧光法测定病毒滴度分别为106.0TCID50/mL、106.25TCID50/mL、106.5TCID50/mL，三个代次收获的病毒液滴度均达到预期，结果见表6，可采用连续收获方式进行病毒的收获。

图1 带毒传代细胞状态显微观察(TB染色，40×)

表6 带毒传代连续收获产毒情况

3 讨论与结论

目前大规模培养PCV2的方法主要有转瓶和生物反应器微载体培养。转瓶工艺存在劳动强度大，需要温室配合，单位面积细胞可用率低等缺点，随着工艺的提升，滚瓶工艺也将逐渐被淘汰；微载体工艺虽说提升了细胞密度，也增加了培养基的使用效率，批间差异小，培养条件可控，但仍存在成本控制、放大传代消化等问题，且两种工艺均需要血清的添加，血清的添加不但使成本增加又存在血清的批间差异大、外源病毒引入、下游纯化去除等问题。因此，驯化一株可无血清全悬浮培养的PK15细胞用于培养PCV2可以将工艺进一步提升。

本文将一株贴壁PK15细胞经过3种培养方法的驯化，将其驯化为可全悬浮无血清培养的PK15细胞并命名为PK15-S，然后进行了PCV2接毒条件的摸索，对接毒时间、MOI、收获时间以及收获方式进行了试验分析。试验结果表明，该细胞培养PCV2，采用批次收获时，接毒时细胞密度为0.5×106/mL，添加2% D-G，接毒量为0.1 MOI，收毒时间为接毒后72 h，病毒滴度为106.4TCID50/mL；但如果采用连续收获，接毒和传代时均使细胞密度为0.5×106/mL，添加2% D-G，接毒量为0.04 MOI，收毒时间为接毒后72 h，连续收获3代，病毒滴度分别为106.0TCID50/mL、106.25TCID50/mL、106.5TCID50/mL，病毒滴度和收获液体积较为理想。

通过本试验可知，带毒传代的细胞在需要传代的72 h，细胞密度分别为4.24×106/mL、2.93×106/mL、2.41×106/mL，细胞密度呈降低趋势，除了第一代带毒细胞外，第二代、第三代均并未达到预期传代密度，虽说PK15感染PCV2后并不引起细胞的病变，但在本试验中随着带毒传代的次数增加，病毒对细胞的生长的确造成了一定的影响，说明仍需对带毒传代细胞的培养环境进行优化和改良，这也意味着第二代、第三代的病毒收获液体积的减少，在实际生产中将会造成产量下降问题。但就整体工艺而言，该株驯化PK15细胞培养PCV2的接毒培养条件和收获方式存在一定可操作性，可为大规模培养PCV2提供数据支撑。