胰腺癌B7-H4与相关血清肿瘤标志物的预后价值研究①

严小甜 钱韵

（浙江大学医学院附属第二医院检验科，杭州 310009）

随着分子生物学和免疫学的不断发展，血清肿瘤标志物在肿瘤的筛查、诊断、判断预后和转归、评价疗效和随诊等方面显示出越来越重要的临床应用价值。

胰腺癌作为一种侵袭性较高的恶性肿瘤，由于缺乏有效的早期诊断方法，导致大多患者确诊时已处于中晚期，手术切除预后差。CA199是胰腺癌目前为止最具敏感性和特异性的肿瘤标志物，并已显示出其在临床辅助诊断中的作用，可普遍用于早期诊断、预后评估以及术后监测复发和转移，但单一标志物的应用仍具有局限性［1-4］。因此，亟需寻求新的肿瘤标志物对胰腺癌进行早期诊断及预后评估。

以往的研究结果显示，胰腺癌组织中B7-H4表达阳性率明显高于非肿瘤患者胰腺组织，且胰腺癌组织中B7-H4的表达水平明显高于对照组。同时，胰腺癌组织中B7-H4的表达水平与TNM分级、远端转移及分化显著相关，此外，B7-H4表达水平可作为独立的胰腺癌预后指标［5-6］。

因此，本研究旨在评估原发胰腺癌患者的肿瘤组织中B7-H4表达水平与术前血清CEA、CA199及CA242表达水平的相关性，探究各标志物在胰腺癌预后中的价值，以期方便快捷地对非手术患者以及术后患者进行有效的评估和监测。

1 资料与方法

1.1 资料本实验共纳入2011年1月至2014年12月在浙江大学医学院附属第二医院确诊为胰腺癌的188例患者。纳入标准：①在2011年1月至2014年12月期间首次诊断为胰腺癌患者；②首次因胰腺癌行根治术或姑息术、且术后病理证实为胰腺导管腺癌患者；③经组织病理学或细胞学诊断为胰腺导管腺癌；④术前尚未进行辅助放化疗或免疫治疗；⑤患者近期未发生感染及自身免疫性疾病；⑥术前进行相关实验室检查。获得的临床数据包括患者信息、肿瘤分化、肿瘤分级和治疗方法。所有组织样本经甲醛固定，石蜡包埋后制成组织切片，并由两名病理医生通过苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色切片明确诊断。本研究遵守浙江大学医学院附属第二医院医学伦理。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色使用EnVisionTM两步法（Dako，斯特鲁普，丹麦）进行免疫组织化学染色。将石蜡包埋组织进行5µm连续切片并转移到干燥免疫组化专用玻片，进行脱蜡、水化、封闭、磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次、羊血清封闭减少非特异性结合，最后将组织与兔抗B7-H4单克隆抗体4℃孵育过夜，随后滴加相应二抗，苏木素复染，乙醇脱水，中性树脂封片。

1.2.2 组织B7-H4染色评分请两位没有接触到患者临床信息的病理医生随机选出5个400倍镜下放大切片视野，进行分析评价，染色结果表明B7-H4高表达于肿瘤细胞质和细胞膜。以半定量方法［6］评估B7-H4的表达，其阳性细胞的比例计分如下：0分（≤5%）；1分（6%~25%）；2分（26%~50%）；3分（51%~75%）；4分（>75%）。染色强度评估如下：0分（无染色）；1分（弱染色，淡黄色）；2分（温和的染色，黄棕色）；3分（强染色，深棕色）。染色积分=阳性比例×染色强度：0分（阴性）；1~4分（弱阳性）；5~8分（中度阳性）；9~12分（强阳性）。本实验设定染色积分<9时，B7-H4为低表达；≥9时，B7-H4为高表达。

1.2.3 血清肿瘤标志物水平检测收集188例胰腺患者手术前1周内静脉血清标本，每份血清1 ml。采用电化学发光法检测血清中CEA及CA199含量，采用流式荧光发光法检测血清中CA242含量，检测方法按试剂盒及仪器说明书进行。判断标准：CEA≥5 ng/ml为 阳 性，CA199≥37 U/ml为 阳 性，CA242≥20 U/ml为阳性。

1.3 统计学分析数据采用SPSS17.0软件统计分析，由单因素方差分析或独立样本t检验分析B7-H4的表达和临床病理特点之间的关系。总生存期（overall survival，OS）的计算为胰腺癌的初诊到患者死亡。采用Kaplan-Meier分析和Tarone-Ware检验分析患者生存期差异。相关性比较采用Pearson或Spearman检验。受试者工作特征（ROC）曲线分析B7-H4以及术前血清肿瘤标志物以及两者联合对胰腺癌患者预后预测的价值，曲线下面积（AUC）比较采用Z检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CEA、CA199及CA242表达水平与患者临床特征的关系188例胰腺癌患者血清标本中，67例CEA阳性（≥5 ng/ml），121例CEA阴性（<5 ng/ml）；154例CA199阳性（≥37 U/ml），34例CA199阴性（<37 U/ml）；109例CA242阳 性（≥20 U/ml），79例CA242阴性（<20 U/ml）。

实验结果表明，血清CEA水平与胰腺癌患者的TNM分期及远端转移有关，Ⅲ+Ⅳ期胰腺癌患者血清CEA水平显著高于Ⅰ+Ⅱ期（P<0.05），有远端转移的胰腺癌患者血清CEA水平显著高于没有远端转移的患者水平（P<0.05）。血清CEA水平与胰腺癌患者的年龄、性别及淋巴结转移无关（P>0.05）。血清CA199及CA242水平均与胰腺癌患者的年龄及远端转移有关，≥65岁的胰腺癌患者血清CA199及CA242水平显著高于<65岁患者（P<0.05），有远端转移的胰腺癌患者血清CA199及CA242水平显著高于没有远端转移的患者水平（P<0.05）。血清CA199及CA242水平与胰腺癌患者的性别、TNM分期及淋巴结转移无关（P>0.05，表1）。

表1 胰腺癌患者肿瘤标志物表达水平与患者临床特征的关系Tab.1 Relationship between expression level of tumor markers and clinical characteristics in patients with pancreatic cancer

2.2 CEA、CA199及CA242表达水平与患者生存期的关系随访至2016年12月，本次回顾性分析的188例胰腺癌患者均已死亡。从Kaplan-Meier生存曲线看，CA199表达阴性组的生存曲线高于CA199阳性组，经Tarone-Ware检验有统计学意义（P=0.046，图1）。CA199阳性患者OS为（9.10±0.66）个月（95%CI：7.81~10.39），CA199阴性患者OS为（12.70±2.77）个 月（95%CI：7.27~18.13）。CEA阳性患者OS为（10.00±1.29）个月（95%CI：7.48~12.52），CEA阴性患者OS为（9.90±0.70）个月（95%CI：8.54~11.27），差异无统计学意义（P>0.05）。CA242阳性患者OS为（9.10±0.48）个月（95%CI：8.17~10.03），CA242阴性患者OS为（10.80±1.24）个月（95%CI：8.36~13.24），差异无统计学意义（P>0.05，表2）。

表2 肿瘤标志物表达水平与患者OS的关系Tab.2 Relationship between expression level of tumor markers and patient OS

图1 Kaplan-Meier生存曲线比较血清CA199水平与OS的关系Fig.1 Using Kaplan-Meier survival curve to compare relationship between serum CA199 level and OS

2.3 B7-H4与CEA、CA199及CA242表达水平之间的相关性经Pearson检验，胰腺癌患者肿瘤组织B7-H4表达水平（积分水平：5.10±2.98）与手术前血清CEA表达水平（23.46±161.00）呈显著正相关（P<0.01），而 与 血 清CA199（1 974.70±3 651.36）及CA242（86.72±132.76）表达水平之间无显著相关性（P>0.05）。经Spearman检验，胰腺癌患者肿瘤组织B7-H4表达阳性率与手术前血清CEA表达阳性率显著相关（P<0.01），而与CA199及CA242表达阳性率无相关性（P>0.05，表3）。

表3 B7-H4与血清肿瘤标志物表达水平的Spearman相关性Tab.3 Spearman correlation between B7-H4 and serum tumor marker expression levels

2.4 B7-H4及血清肿瘤标志物对胰腺癌患者预后的预测价值胰腺癌患者B7-H4染色积分及术前血清肿瘤标志物浓度预测术后6个月生存期的ROC曲线见图2，AUC见表4，统计学分析见表5。经Z检验，B7-H4染色积分的AUC（95%CI）为0.705（0.629~0.773），明显高于CEA的0.508（0.429~0.586）和CA242的0.518（0.439~0.596），差异具有统计学意义（Z=2.726，Z=2.524；P<0.05）；而略高于CA199的0.577（0.498~0.653），差异无统计学意义（Z=1.812，P>0.05）。

由上述ROC曲线分析明确，B7-H4染色积分和CA199具有预测胰腺癌患者术后6个月生存期的价值。因此，同时分析了胰腺癌患者B7-H4染色积分联合术前血清CA199预测术后6个月生存期的ROC曲线见图2，AUC见表4，统计学分析见表5。经Z检验，B7-H4染色积分联合术前血清CA199的AUC（95%CI）为0.717（0.646~0.782），明显高于CA199，差异具有统计学意义（Z=2.275，P<0.05）；而比B7-H4染色积分略高，差异无统计学意义（Z=0.614，P>0.05）。

图2 B7-H4及血清肿瘤标志物预测胰腺癌患者预后的ROC曲线Fig.2 ROC curve of B7-H4 and serum tumor markers in predicting prognosis of patients with pancreatic cancer

表4 B7-H4与血清肿瘤标志物预测胰腺癌患者预后的AUC面积对比Tab.4 Comparison of AUC area between B7-H4 and serum tumor markers in predicting prognosis of patients with pancreatic cancer

表5 B7-H4与血清肿瘤标志物预测胰腺癌患者预后的差异比较（P value，Z value）Tab.5 Comparison of B7-H4 and serum tumor markers in predicting prognosis of patients with pancreatic cancer（P value，Z value）

3 讨论

胰腺癌作为消化道恶性度最高的肿瘤之一，具有高侵袭性、隐匿性及易复发转移的特点［7］。因此，寻找有效的生物标志物用于评估胰腺癌切除患者预后显得尤为重要。

血清CEA、CA199和CA242是检测胰腺癌常用的血清标志物［4，8］。CEA属于免疫球蛋白超家族成员，是消化道肿瘤最常用的肿瘤标志物之一［9］。CEA被广泛用于辅助肿瘤的诊断及预后评估，特别是用于术后肿瘤复发转移的监测，相比于血清CEA正常的患者，血清CEA异常患者的预后更差［10］。本研究发现胰腺癌患者术前血清CEA水平与胰腺癌TNM分期及远端转移相关。遗憾的是，本研究中并未发现术前CEA水平与胰腺癌患者术后生存期相关，这可能与CEA在胰腺癌诊断与预后评估中，其敏感性和特异性都较低有关，因此往往和其他肿瘤标志物联合诊断［10］。

CA199是一种黏蛋白型糖类肿瘤标志物，不仅可用于胰腺癌的辅助诊断，也可用于胰腺癌预后判断［11-12］。术后CA199正常或术前轻度升高（<100 U/ml）提示预后良好，而CA199血清水平术前>100 U/ml或术后>37 U/ml则与不良预后有关［13-14］。本研究发现胰腺癌患者术前血清CA199水平与胰腺癌患者远端转移及术后生存期有关，表明血清CA199可能具有预测胰腺癌细胞的生物学行为的作用及预测胰腺癌患者术后6个月生存期的价值。

CA242是一种唾液酸化鞘脂类抗原，存在于胰腺癌和结肠癌细胞中，且其表达水平不受胆管良性疾病、急性胰腺炎等病变影响，在胰腺癌的鉴别诊断中有着较佳的特异性［15-16］。胰腺癌患者血清CA242水平与病程进展有一定的平行相关性，CA242水平的升高被认为与肿瘤的肝转移及预后密切相关［17］。本组资料显示，胰腺癌患者术前血清CA242在预测肺癌转移中具有一定价值，但无法预测患者术后生存期。

研究表明，胰腺癌的发生发展与许多免疫分子相关［17］。B7-H4是调控免疫细胞应答重要的负性共刺激分子，与肿瘤逃避免疫监视以及肿瘤生长、转移和预后密切相关［18-19］。之前的研究发现B7-H4在中晚期胰腺癌中表达增高，在远端转移阳性组表达高于远端转移阴性组，提示与肿瘤进展与转移有关［5］。这一结果说明，B7-H4可能在胰腺癌的生物学演进上扮演了重要角色，有作为胰腺癌恶性生物学行为标记的潜在价值。本研究发现，在预后方面，血清CA199和组织B7-H4可能具有重要的临床价值。

本实验还分析了胰腺癌组织B7-H4与术前血清CEA、CA199和CA242之间的关系。结果表明，组织中B7-H4作为评估胰腺癌患者术后生存期的价值优于CEA和CA242，B7-H4与CA199联合预后的价值优于单独CA199。总之，B7-H4与血清肿瘤标志物联合检测在胰腺癌的早期诊断及预后评估中具有重大的临床意义，且检测方便，减轻患者负担，具有进一步推广其临床应用的价值［20］。

总之，本研究表明联合检测B7-H4/CA199对胰腺癌患者的预后具有潜在的指导意义。本研究也存在一定的局限性：首先，本研究为单中心回顾性研究，有待未来开展前瞻性研究加以证实；其次，本研究入组患者为术前检测血清肿瘤标志物水平的患者，将未检测术前血清标志物水平的患者排除在外，可能产生选择偏倚，从而影响研究结果。