紫草素通过调节PI3K/AKT 途径抑制骨肉瘤生长和作用机制研究

杨志强陈 路张雅茜夏先学

(川北医学院附属医院骨科,四川南充 637000)

骨肉瘤主要发生在儿童和青少年中,是最常见的原发性骨恶性肿瘤类型[1]。 目前,骨肉瘤的治疗方法包括新辅助化疗、外科手术切除、介入疗法以及冷热消融。 但是,由于肺转移和对化疗的耐药性,骨肉瘤的5 年生存率很难达到80%[2]。 此外,目前批准的药物表现出严重的副作用。 因此,需要在OS 治疗中开发具有更高效率和降低毒性的新型药物。 紫草素(shikonin,SK)是从中草药紫草中提纯的天然萘醌成分(化学结构式如图1 所示),具有广泛的生物学活性,包括抗炎、增强机体免疫力等。研究表明,紫草素对口腔癌、肝细胞癌等均具有抑癌作用[3-5]。 缪明星等[6]发现SK 通过内质网应激蛋白抑制人骨肉瘤U2OS 细胞的增殖。 Yang 等[7]研究发现 SK 通过上调骨肉瘤中的 caspase-3 和caspase-8 来促进阿霉素诱导的凋亡,Deng 等[8]研究发现SK 通过抑制MMP13 抑制骨肉瘤的浸润。 上述研究结果表明SK 在骨肉瘤中主要是通过抗增殖、侵袭及促凋亡发挥抗癌作用,但SK 对骨肉瘤干细胞样特征未曾报道。 本研究不仅发现SK 对骨肉瘤生长、侵袭的抑制作用,而且发现SK 抑制骨肉瘤的干细胞样特征,并进一步证实SK 通过抑制PI3K/AKT 途径发挥抗骨肉瘤的作用。

图1 紫草素结构式Figure 1 Structure formula of shikonin

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞

人骨肉瘤细胞株MG-63、U2OS 和人成骨细胞HFOB1.19 购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。所有细胞在含有10%FBS,100 U/mL 的青霉素和100 μg/mL 的链霉素的 DMEM 培养基中,于 37℃、5% CO2的潮湿培养箱中培养。

1.1.2 实验动物

14 只 SPF 级雄性 BALB/c 裸鼠(4 ～ 5 周龄,15～18 g)由川北医学院提供[SCXK(川)2018-18]。将裸鼠饲养于川北医学院SPF 动物房中并在该处完成动物实验[SYXK(川)2018-076],房间温度控制在23℃～27℃,湿度维持在50%～60%,光照时间12 h,并喂以水和标准实验室食物。 在实验之前,所有小鼠适应环境1 周。 实验经北川动物伦理委员会审核批准(IACUC-20200316-03),所有实验操作遵循3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

紫草素(＞97%,shikonin,SK)(货号:E-0403)购自上海同田生物技术有限公司；胎牛血清(FBS)、链霉素和青霉素购自美国Gibco 公司；B27 购自美国Invitrogen；人表皮生长因子(EGF)人成纤维生长因子(bFGF)购自美国 Pepro Tech 公司；CCK-8 试剂盒、RIPA 裂解液、ECL 发光液和BCA 试剂盒购自上海碧云天公司；PVDF 膜购自美国Millipore 公司；兔抗B 细胞淋巴瘤2(Bcl-2)(ab182858)、B 细胞淋巴瘤2 相关的X 蛋白(Bax)(ab32503)、兔抗磷酸化磷脂酰肌醇 3-激酶(p-phosphoinositide 3-kinase,p-PI3K)(ab278545)、兔抗 SOX-2 抗体(ab92494),兔抗 OCT-4 抗 体 (ab200834)、 兔 抗 Nanog 抗 体(ab109250)、Ki67(ab92742)和 HRP 偶联的山羊抗兔IgG 抗体(ab6721)购自英国Abcam 公司；兔抗β-肌动蛋白(β-actin)(＃4970)；兔抗胱天蛋白酶-3(caspase-3,cas3)(＃9662)、兔抗活化胱天蛋白酶-3(cleaved cas3)(＃9664)、兔抗蛋白激酶 B(protein kinase B,AKT)(＃9272)、兔抗 p-AKT(＃4060)和PI3K(＃4255)；胰岛素样生长因子1(IGF-1)(bs-4588P)购自北京博奥森生物技术有限公司。 iMark酶标仪及蛋白电泳设备(美国Bio-Rad)；Accuri C6流式细胞仪(美国BD Biosciences)；BX43 荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)；TanoN5200 凝胶成像仪(上海天能公司)。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8 试验检测细胞活力

将人成骨细胞HFOB1.19 及人骨肉瘤U2OS 和MG63 细胞接种到含有100 μL 完全培养基的96 孔板(每孔 5×103细胞)中,培养 24 h。 然后,用 100 μL 含有不同浓度SK 的新鲜培养基处理24 h 或用含有 SK 1 μmol/L 的培养基分别处理 24、48 和 72 h后,向每个孔中加入10 μL CCK-8,37℃孵育2 h,使用酶标仪测量450 nm 处的吸光度。

1.3.2 克隆形成实验检测细胞增殖

将骨肉瘤U2OS 细胞(每孔500 个细胞)接种到6 孔板中,培养过夜。 分别用 SK 0、0.01、0.1 和 1 μmol/L 处理48 h,再常规培养6 d。 用4%多聚甲醛固定细胞集落,然后用0.1%结晶紫染色,显微镜下观察。

1.3.3 流式细胞检测细胞凋亡

收集紫草素 SK 0、0.01、0.1 和 1 μmol/L 处理24 h 后的 U2OS 细胞,并用冷 PBS 洗涤 3 次,然后在暗室中孵育Annexin V-FITC(5 μL)和 PI(5 μL)15 min。 随后,使用流式细胞仪分析细胞。

1.3.4 Western blot 检测蛋白表达

使用冷RIPA 缓冲液裂解细胞,并在4℃离心,收集上清液。 BCA 蛋白质测定试剂盒检测蛋白质浓度。 通过SDS-PAGE 分离等量(40 μg)的总蛋白质,并转移到PVDF 膜上,封闭膜并与相应的一抗(β-actin 1 ∶1000、Bcl-2 1 ∶2000、Bax 1 ∶1000、cleaved caspase-3 1 ∶1000、Ki67 1 ∶1000、p-AKT1 ∶2000、AKT 1 ∶1000、p-PI3K 1 ∶ 1000、 PI3K 1 ∶1000、SOX-2 1 ∶1000、OCT-4 1 ∶10000 和 Nanog 1 ∶1000)在4℃下孵育过夜,然后与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG(1 ∶2000)在室温下孵育2 h,通过ECL 发光液显影,使用Image J 软件进行条带灰度值分析。

1.3.5 细胞成球实验

将U2OS 细胞以2000 细胞/孔的密度接种到6孔超低附着板中,在含有1% B27 补充剂,10 ng/mL人 EGF 和 10 ng/mL 人 bFGF 的无血清 DMEM 培养基中培养。 1 周后,观察球体并通过显微镜拍摄照片。

1.3.6 验证SK 对U2OS 细胞的作用机制

将 U2OS 细胞分为对照组,SK 1 μmol/L 组,IGF-1 组和 SK 1 μmol/L+IGF-1 组,用 PI3K 途径特异性激活剂 IGF-1(10 nmol/mL)将 IGF-1 和 SK 1 μmol/L+IGF-1 组中的细胞预处理12 h。 然后进行上述实验。

1.3.7 移植瘤实验

将约 3×106U2OS 细胞悬浮在 100 μL PBS 中,皮下接种到裸鼠的右侧腹中。 注射后3 d,将小鼠随机分为对照组,SK 2 mg/kg 组[9],每组7 只,SK 2 mg/kg 组每隔 1 d 腹膜内注射 100 μL SK(2 mg/kg),对照组注射等量的生理盐水。 每3 d 测量1 次肿瘤的长度和宽度,通过公式V=1/2(宽度2×长度)计算肿瘤体积。 实验结束时,切除肿瘤并称重。 固定肿瘤并包埋在石蜡中,切成薄片。

1.3.8 免疫组化染色检测p-AKT 和Ki67 的表达

将组织切片在二甲苯中脱蜡,使用梯度乙醇水化,然后用3% H2O2处理15 min。 使用沸腾的柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)提取抗原,10 min 后将组织切片与10%山羊血清孵育15 min,并与p-AKT(1 ∶100)和 Ki67(1 ∶500)的一抗在 4℃孵育过夜。 将载玻片用 PBS 洗涤3 次,使用二抗(1 ∶500)在37℃下孵育切片30 min,并用苏木素复染细胞核。

1.3.9 TUNEL 染色检测瘤组织细胞凋亡

将肿瘤组织切片脱蜡和水合后,用PBS 冲洗2次,然后在37℃下与20 μg/mL 蛋白酶K 一起孵育25 min,PBS 洗涤3 次。 按照制造商的说明,将所有切片与TUNEL 混合物一起孵育,显微镜下观察组织切片。

1.4 统计学方法

使用GraphPad Prism 5 进行数据统计分析。 所有数据均显示为至少3 次独立实验的平均数±标准差( ˉx±s),使用Student’st检验进行两组之间的比较。P＜0.05 被认为具有显著性差异。

2 结果

2.1 SK 抑制骨肉瘤细胞增殖

如图2A、2B 所示,SK 对人成骨细胞HFOB1.19无明显细胞毒性,对骨肉瘤细胞MG63 和U2OS 均具有明显的细胞毒性作用(P＜0.05),且随着SK 浓度和处理时间的增加而增强。 选择对SK 更为敏感的U2OS 细胞系,SK 浓度为 0、0.01、0.1 和1 μmol/L继续研究。与 SK 0 μmol/L 组比较, SK 0.1 和1 μmol/L明显抑制U2OS 细胞的克隆形成(图2C)。

图2 SK 对骨肉瘤细胞增殖的影响Note. A, Effect of different concentrations of SK on the viability of human osteoblasts and osteosarcoma cells. B, Effect of SK on the viability of human osteoblasts and osteosarcoma cells at different times. C,Colony forming rate of U2OS cells in each group. Compared with SK 0 μmol/L group,*P＜0.05.Compared with 0 h group,＃P＜0.05.Figure 2 Effect of SK on the proliferation of osteosarcoma cells

2.2 SK 促进骨肉瘤细胞凋亡

如图 3 所示,与 SK 0 μmol/L 组比较,SK 0.1 和1 μmol/L 组 U2OS 细胞凋亡明显增加(P＜0.05),Bax/Bcl-2 和cleaved cas3/cas3 比值均显著上调(P＜0.05)。 SK 0.01 μmol/L 组无显著性差异。

图3 SK 对骨肉瘤细胞凋亡的影响Note. A, Flow cytometry was commended to detect the apoptosis rate of each group. B, Western blot was used to test the expression of apoptosis protein in each group. Compared with SK 0 μmol/L group,*P＜0.05.Figure 3 Effect of SK on apoptosis of osteosarcoma cells

2.3 SK 通过抑制PI3K/AKT 信号通路抑制骨肉瘤细胞生长

如图 4 所示,与对照组比较,SK 1 μmol/L 组U2OS 细胞中PI3K 和AKT 蛋白磷酸化水平及Ki67表达水平显著降低(P＜0.05),cleaved cas3/cas3 比值显著上调(P＜0.05),IGF-1 组 PI3K 和 AKT 蛋白磷酸化水平及Ki67 和cleaved cas3/cas3 比值无显著差异；与 SK 1 μmol/L 组比较,SK 1 μmol/L+IGF-1 组 p-AKT、p-PI3K 和 Ki67 蛋白表达明显上调(P＜0.05),cleaved cas3/cas3 比值显著下调(P＜0.05)。

图4 SK 通过调控PI3K/AKT 信号通路对骨肉瘤细胞生长的影响Note. A, Western blot was performed to assay the protein expression in each group. B, Relative protein expression. Compared with the control group,*P＜0.05. Compared with the SK 1 μmol/L group,＃P＜0.05.Figure 4 Effect of SK on the growth of osteosarcoma cells by regulating the PI3K/AKT signaling pathway

2.4 SK 通过抑制PI3K/AKT 信号通路抑制骨肉瘤细胞的干细胞样特征

如图 5 所示,与对照组比较,SK 1 μmol/L 组U2OS 细胞成球数量减少,成球直径减小(P＜0.05),SOX-2、OCT-4 和 Nanog 蛋白表达显著下调(P＜0.05)；与 SK 1 μmol/L 组比较,SK 1 μmol/L+IGF-1 组U2OS 细胞成球数量增多,成球直径增大(P＜0.05),SOX-2、OCT-4 和 Nanog 蛋白表达显著上调(P＜0.05)。

图5 SK 通过调控PI3K/AKT 信号通路对骨肉瘤细胞干细胞样特征的影响Note. A, Cell spheroidization. B, Number of spheres of each group. C, Diameter of spheres of each group. D, Western blot was used to detect the expression of SOX-2, OCT-4 and Nanog protein in each group. E, Relative protein expression. Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the SK 1 μmol/L group,＃P＜0.05.Figure 5 Effect of SK on the stem cell-like characteristics of osteosarcoma cells by regulating the PI3K/AKT signaling pathway

2.5 SK 在体内抑制骨肉瘤肿瘤的生长

如图6 所示,与对照组比较,SK 2 mg/kg 组肿瘤质量和体积明显减小(P＜0.05),瘤组织中p-AKT和Ki67 的表达显著降低(P＜0.05),凋亡细胞显著增加(P＜0.05)。

图6 SK 在体内对骨肉瘤肿瘤生长的影响Note. A, Nude mouse transplanted tumor. B, Tumor volume. C, Tumor mass. D, p-AKT immunohistochemical staining. E, TUNEL staining was employed to measure tumor tissue cell apoptosis. F, Ki67 immunohistochemical staining. Compared with the control group,*P＜0.05.Figure 6 Effect of SK on the growth of osteosarcoma tumor in vivo

3 讨论

辅助疗法的出现和外科技术的进步,已使骨肉瘤患者的总生存率达到60%～75%[2]。 由于副作用和耐药性的发展,目前的化学药物受到限制。 因此,鉴定副作用较小的有效药物对于骨肉瘤的治疗至关重要。 SK 是中药的主要活性成分之一,研究表明紫草素已被用作化疗增敏剂,以增强传统肝细胞癌化疗药物的抗癌作用,如三氧化二砷、多柔比星和顺铂[10-11]。 已有研究报道SK 通过抑制骨肉瘤细胞的侵袭和诱导凋亡在骨肉瘤中发挥着抑癌作用[7-8]。 本研究表明,SK 对人成骨细胞HFOB1.19为表现出明显的细胞毒性,对骨肉瘤U2OS 和MG63细胞均表现出显著的细胞毒性,且具有时间和浓度依赖性。 本研究结果表明SK 抑制U2OS 细胞增殖和骨肉瘤癌症干细胞样特征,诱导细胞凋亡,并进一步探究了SK 作用的相关分子机制。

Bax 是Bcl-2 家族的促凋亡成员,它形成的离子通道直接导致线粒体释放细胞色素c,然后激活caspase-9 和 caspase-3,从而在末端诱导凋亡[12]。PI3K/AKT 途径的激活可以促进各种人类癌症的发展,例如卵巢癌、肺癌、黑色素瘤和淋巴瘤[13-14]。PI3K/AKT 途径通过调节许多下游转录因子在癌症的多个过程中(例如凋亡、增殖和转移)起着至关重要的作用[15]。 我们发现 SK 处理可诱导骨肉瘤U2OS 细胞明显凋亡,并显著上调cleaved cas3/cas3和 Bax/Bcl-2 比值。 此外,SK 明显抑制 PI3K/Ak 通路激活及 Ki67 的表达,促进 cleaved cas3 表达,而PI3K 激活剂IGF-1 可显著逆转SK 对PI3K/AKT 通路及Ki67 表达的抑制以及SK 对cleaved cas3 的上调作用。 我们的体内实验结果表明SK 可明显抑制体内肿瘤的生长,降低瘤组织中p-AKT 和Ki67 的表达,诱导细胞凋亡。 因此,SK 可能是通过抑制PI3K/AKT 途径抑制U2OS 细胞的生长,与之前的研究一致[16]。

越来越多的证据表明,骨肉瘤具有癌症干细胞(CSC),这些亚群被认为与化学耐药性,肿瘤转移和复发有关,这应该是开发新药的有希望的目标[17-18]。 有证据表明PI3K/AKT 信号传导途径可调节干细胞标志物的表达以维持CSC 特性[19]。 多能干细胞因子,包括SOX-2、OCT-4 和Nanog,被确定为诱导多能干细胞形成的核心因子,并在维持正常和癌症干细胞的干性中起关键作用[20]。 这些多能干细胞因子在癌细胞中的过表达被证明参与了肿瘤的发生,转移和癌症复发[21]。 我们的结果表明,SK 明显抑制骨肉瘤干细胞样性状,细胞成球大小和直径显著减小,干细胞标记物 SOX-2、OCT-4 和Nanog 的表达显著下调,IGF-1 明显逆转SK 对干细胞样特征的抑制作用。 因此,SK 可能是通过抑制PI3K/AKT 途径抑制骨肉瘤干细胞样特征。

基于体内和体外实验,该研究证明了SK 在骨肉瘤U2OS 细胞中发挥着抗癌作用,其潜在机制可能是通过抑制PI3K/AKT 途径抑制U2OS 细胞的生长和干细胞样特征并诱导细胞凋亡,提示SK 可能是抗人骨肉瘤的有前途的药物。