参味宁郁片对三种药物诱发动物模型的抗抑郁作用研究

王雅欣郭姗姗高英杰图 娅崔晓兰*

(1.中国中医科学院中药研究所,北京 100700； 2.北京中医药大学针灸推拿学院,北京 100029)

抑郁症已经成为近年来严重危害人类健康的常见精神类疾病之一,约有3.5 亿人正受抑郁症的困扰[1],重度抑郁症在全球范围内患病率逐年升高,给公共卫生系统带来极大的负担[2],然而因其致病因素复杂、临床表现多样[3]、发病年龄跨度较大,且常作为其他疾病的并发症,这些因素都极大阻碍了抑郁症的治疗及相关药物的研发工作,且常用的抗抑郁药物通常具有副作用大且病情易复发等缺点[4],所以近年来的天然抗抑郁药物逐渐受到广泛关注[5]。

抗抑郁新药-参味宁郁片是由郁金、酸枣仁、西洋参、五味子4 味中药材组成,其中郁金的重量份为600 ～ 1200、酸枣仁为 600 ～ 1200、西洋参为 100 ～600、五味子为 400 ～ 1000。 该药在 2005 年获得CFDA 临床研究批件(批件号:2005L02629),并于2007 年 2 月 获 国 家 发 明 专 利 ( 专 利 号:ZL031531040),它作为国内首个批准进入临床试验的治疗抑郁症的纯中药小复方制剂(6.1 类)能够调节慢性束缚模型大鼠的免疫炎性反应,临床试验证实该药对于治疗气阴两虚型抑郁症有显著疗效[6]。

目前关于抑郁症发病机制的研究主要有单胺类神经递质假说、受体假说、下丘脑-垂体-肾上腺轴假说等[7]。 本次研究主要以单胺类神经递质假说为依据展开,因使用单一抑郁症模型易产生假阳性或受到主观偏好的影响,而使用多种抑郁模型进行试验能更准确判断药物的抗抑郁效果[8]。 故本实验中使用3 种药物诱发的不同动物模型来探索参味宁郁片的抗抑郁作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验纳入6 周龄雄性SPF 级SD 大鼠60 只,体重 160～180 g；KM 小鼠雄性 120 只,体重 13 ～15 g。 实验动物均由北京维通利华公司实验动物中心提供[SCXK(京)2016-0011]。 动物饲养于中国中医科学院中药研究所屏障动物实验设施[SYXK(京)2016-0013],并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。 本实验中所有操作均遵循国家卫生研究院(national institutes of health, NIH)及北京市实验动物伦理委员会的规定。

1.2 主要试剂与仪器

受试药物:参味宁郁片(实验采用压片前的药粉),由郁金、酸枣仁、西洋参、五味子4 味中药材组成,经中国中医科学院中药研究所剂型室提供,批号:030802。 性状:浅棕色粉末。 阳性对照:百忧解,英国礼来公司产品,批号(98)卫药准字J-23 号。 临床适应症:抑郁症。 剂型:胶囊。 用法用量:20 ～40 mg/d,口服给药。 实验试剂:重酒石酸去甲肾上腺素(上海禾丰制药有限公司产品,批号:沪卫药准字(1995) 第 010044 号)；5-羟色胺酸(Sigma 公司产品,批号:035G4672)；盐酸帕吉林(Sigmag 公司产品,批号:053K3675)；盐酸色胺(中国医药公司北京采购供应站提供,批号850906)。 实验仪器:小鼠自主活动记录仪(DPOT-VARIMEX.3 型,美国产品)；小鼠悬尾平衡支架(自制)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组

将实验动物进行适应性喂养后采用随机数字表(随机数字由SPSS 25.0 统计学软件产生)将大鼠及小鼠分为正常组、模型组、百优解组、参味宁郁片高剂量、中剂量组和低剂量组共6 组,每组10 只。

1.3.2 给药方法

剂量设计:参味宁郁片:人临床用量为34 g/60(kg·d),即0.57 g/(kg·d),换算成小鼠用量即为3、6、12 g/(kg·d),大鼠用量即为 1.5、3、6 g/(kg·d),均分别相当于人临床用量的1/2 倍、等倍和2倍。 百忧解:临床人用量为40 mg/60(kg·d),实验时小鼠用量为5.2 mg/(kg·d)；大鼠用量为2.6 g/(kg·d)；均为临床等效用药量。

给药方式:小鼠按0.2 mL/10 g 灌胃给药,大鼠按1 mL/100 g 灌胃给药。

1.3.3 实验方法

加强单胺作用实验-5-HTP 诱发小鼠甩头模型[9-10]:各给药组灌胃给药,正常、模型组给予等量的生理盐水,每天1 次,连续6 d,第7 天除正常对照组外,其余各组动物腹腔注射盐酸帕吉林100 mg/kg,浓度为 6 mg/mL。 1 h 后给药 1 次,再过 30 min,尾静脉注射10 mg/kg 的5-HTP,浓度为0.8 mg/mL,正常对照组给予生理盐水。 之后立即放入24 cm×15 cm×15 cm 的小鼠箱内,观察小鼠每5 min 内的甩头次数,共测定25 min。 5-HTP 诱发小鼠甩头模型是预先给予5-HTP 药物后使外源性5-HT 水平上升进而出现甩头行为[11]。

抑制NE 重吸收实验-增强NE 对小鼠的毒性实验[12]:各给药组灌胃给药,正常、模型组给予等量的生理盐水,每天1 次,给药量为0.2 mL/10 g,连续给药1 周。 除正常对照组外,其余各组于第7 天灌胃1 h 后,皮下注射NE(12 mg/kg),药物浓度为1.2 mg/mL 然后将小鼠置于塑料笼中,自由饮水、进食。观察各组小鼠的死亡数,48 h 后统计死亡率,死亡率=(死亡数/动物总数)×100%。 能够抑制 NE 重摄取的抗抑郁药可以显著提高NE 的浓度,也能增强外源性给予NE 的毒性,此模型主要适用于NE 重摄取抑制剂[13]。

MAO 抑制实验-对增强色胺引起大鼠惊厥模型的影响:各给药组灌胃给药,正常、模型组给予等量的生理盐水,每天1 次,连续7 d。 第7 天给药后除正常组外各组于给药后1 h 尾静脉注射新鲜配制的盐酸色胺溶液(6 组大鼠交叉进行注射)10 mg/kg,浓度为2 mg/mL。 然后逐只观察前肢特有的阳性反应-阵挛性“蹬踩”运动。 色胺作为单胺氧化酶的底物在大鼠注射后可出现阵挛性惊厥反应,具有单胺氧化酶抑制作用的抗抑郁药物可增强色胺引起的惊厥作用[14]。

1.4 统计学方法

待实验结束后,各组数据采用SPSS 25.0 进行统计,实验结果均以平均数±标准差()表示。 组间比较用单因素方差分析,P＜0.05 表示差异具有统计学意义；死亡率统计用χ2检验,为降低Ⅰ型错误的概率,P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 加强单胺作用实验——5-HTP 诱发小鼠甩头模型

表1 中结果显示:正常组不出现甩头现象,与正常组相比,模型组出现明显的甩头现象,与模型组相比,各给药组的甩头次数明显增多,其中低剂量组稍高于高、中剂量组,各给药组与模型组比较均具有显著性差异(P＜0.05)。

表1 参味宁郁片对5-HTP 诱发小鼠甩头次数的影响(n=10)Table 1 Effect of Shenwei Ningyu tablets on 5-HTP-induced head-shaking in mice

2.2 抑制NE 重吸收实验——增强NE 对小鼠的毒性实验

表2 结果显示:与正常组相比,皮下注射NE(12 mg/kg)后模型组小鼠的死亡率为10%,与模型组相比,参味宁郁片各给药组小鼠的死亡率均明显增加,其中低剂量组为60%,与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。

表2 参味宁郁片增强NE 对小鼠的毒性实验(n=10)Table 2 Effect of Shenwei Ningyu tablets on enhancing the toxicity of NE in mice

2.3 MAO 抑制实验——对增强色胺引起大鼠惊厥模型的影响

表3 结果显示:正常组动物不出现“蹬踩”运动,与正常组相比,模型组的动物可出现明显的“蹬踩”运动。 与模型组相比,各给药组动物造模后的“蹬踩”运动次数较模型组虽有明显增多,但并无显著性差异(P＞0.05)。

表3 参味宁郁片对增强色胺引大鼠惊厥试验的影响(n=10)Table 3 Effects of Shenwei Ningyu tablets on enhancing tryptamine-induced convulsion test in rats

3 讨论

抑郁症是一种病因复杂的精神类疾病,目前关于其发病机制的研究主要集中在中枢单胺类神经递质如5-HT、NE 和多巴胺(DA)等方面[15],大多数抗抑郁药可通过抑制单胺类递质重吸收、抑制MAO活性等方式体现药效[16]。 5-HT 作为一种常见的单胺类神经递质,在神经元中常参与包括情绪、睡眠及认知功能等方面的调控[17],早在19 世纪50 年代就有临床实验发现与正常人相比抑郁症患者脑内缺乏5-HT[18],因此如何抑制5-HT 在患者脑内的代谢过程成为治疗抑郁症的关键环节。

鉴于参味宁郁片抗抑郁的具体机制尚不明确,本研究通过建立3 种不同的动物模型对参味宁郁片的抗抑郁作用进行初步探索。 在5-HT 诱发小鼠甩头模型中,与模型组相比,参味宁郁片3 个剂量组的甩头次数均有所增多,其中小剂量组甩头次数最多,其次,在增强NE 对小鼠的毒性实验中,与模型组比较各给药组小鼠的死亡率均明显增加,其中低剂量组具有显著性差异,此外,在增强色胺引大鼠惊厥模型的实验中,各给药组动物造模后的“蹬踩”运动次数较模型组均有一定程度的增加,但与模型组比较并无显著性差异。

在小鼠甩头模型及小鼠毒性实验的研究中发现参味宁郁片低剂量组具有更明显的抗抑郁作用,这可能由以下两方面原因导致,其一是有些中药材随着用量的加大会影响甚至改变其临床疗效[19],因此可能是导致本实验中量效关系不明显的因素之一。 其次是高浓度的药液可能会影响机体对药物有效成分的吸收从而影响药效,与高剂量组相比,如果低剂量组在确保疗效的基础上更容易增加机体对其有效成分的利用度,那么低剂量组可能具有更显著的疗效。

以上实验结果显示参味宁郁片可能是通过作用于NE 能系统、阻断中枢5-HT 等单胺类递质的重摄取使5-HT 增多等两个方面发挥抗抑郁作用,对于该药是否具有MAO 抑制作用的抗抑郁药效还有待进一步研究。