胆固醇调节元件结合蛋白-1基因对高寒草原饲养西门塔尔牛血液脂肪酸组成的影响

李新淼 王圆圆 HESHUOTE Mailisi 白玉廷 包音都古荣·金花* 呼格吉勒图 敖日格勒 薛 强

(1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区生物制造重点实验室，呼和浩特 010018；3.哥伦比亚大学，纽约 10027，美国；4.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018；5.内蒙古贺斯格绿色产业进出口有限公司，锡林郭勒 026321)

西门塔尔牛因其优秀的屠宰率、瘦肉率和肉用性能而成为我国主要的肉牛品种之一，其肉品质和风味研究受到许多学者的重视[1]。肌内脂肪(IMF)含量和成分是判定牛肉大理石花纹、色泽、口感及嫩度等肉品质的重要影响因素，而IMF中脂肪酸组成对其有很大影响[2-4]。特别是IMF中单不饱和脂肪酸(MUFA)含量，可降低脂肪熔点，使脂肪变得柔软，有助于改善牛肉的风味和嫩度[5]。IMF中脂肪酸的组成受多种因素调节，其中就包括遗传因素。目前已证实许多基因可影响脂肪酸组成，如硬脂酰基辅酶A脱氢酶(SCD)[6]、脂肪酸合成酶(FASN)[7]、生长激素(GH)[8]、瘦素[9]基因等。胆固醇调节元件结合蛋白-1(sterol-regulatory element binding protein-1，SREBP-1)是一类转录因子，通过促进糖酵解和脂肪生成，在能量平衡中发挥重要作用[10]。SREBP-1基因参与调控脂肪代谢和生长发育的代谢通路，其表达对于脂肪细胞分化和脂肪沉积至关重要[11]。通过对不同动物的不同组织研究发现，SREBP-1基因在不同动物中均有表达，且在不同组织中的相对表达量不同[12-14]。Hoashi等[15]对日本和牛SREBP-1基因第5内含子84 bp插入缺失多态性分析发现，SS基因型具有较高的MUFA含量和较低的脂肪熔点。本试验选用乌拉盖高寒草原饲养的纯种西门塔尔牛作为研究对象，通过测定血液中SREBP-1基因表达与脂肪酸组成和含量，分析SREBP-1基因表达及其不同基因型对脂肪酸组成和含量的影响，为今后西门塔尔牛繁育中优良遗传基因的保留提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验牛均为产自内蒙古锡林郭勒盟乌拉盖草原(年平均气温-0.9 ℃)的纯种西门塔尔公牛，15月龄前在此草原上放牧饲养，自由运动和采食，16～18月龄后于内蒙古乌兰察布市四子王旗育肥饲养。本试验从200头牛群中随机选取30头牛，在04:00放牧前，使用含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的15 mL采血管从牛颈静脉处采集血液，充分摇匀，取10 mL血液移至2个5 mL无菌无酶的冻存管中，标记牛号，投入液氮中保存，用于实时荧光定量PCR及脂肪酸含量和组成的测定。

1.2 总RNA提取和cDNA合成

采用TRIzol法提取血液中的总RNA，提取的总RNA经微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯度和完整性，符合要求后，立即使用反转录试剂盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit)进行cDNA的合成。

1.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR所使用的SREBP-1和β-肌动蛋白(β-actin)基因引物均参考付常振等[16]的引物序列。SREBP-1：5’-CAATGTGTGAGAAGGCCAGT-3’(正向引物)和5’-ACAAGGAGCAGGTCACACAG-3’(反向引物)；β-actin：5’-CCAACGTGTCTGTTGTGGAT-3’(正向引物)和5’-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’(反向引物)。目的基因和内参基因引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以西门塔尔牛血液RNA反转录的cDNA模板，β-actin为内参，利用LightCycler480实时荧光PCR系统进行实时定量扩增，预变性95 ℃ 30 s进行1个循环，PCR分析模式为定量分析95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s 进行40个循环，熔解分析模式为熔解曲线95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃进行1个循环，降温50 ℃ 30 s进行1个循环。每个样品重复3次。采用相对定量的方法，使用2-△△Ct法计算西门塔尔牛血液中SREBP-1基因相对表达量。

1.4 全基因组DNA提取和PCR扩增

使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取血液全基因组DNA。提取的DNA经微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯度和完整性，符合要求后，进行PCR扩增，引物参考Hoashi等[15]发表的SREBP-1基因引物序列，5’-CCACAACGCCATCGAGAAACGCTAC-3’(正向引物)和5’-GGCCTTCCCTGACCNCCCAACTTAG-3’(反向引物)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应在94 ℃变性5 min后进行30个循环，包括94 ℃变性30 s，63.9 ℃变性30 s，72 ℃变性1 min，72 ℃变性7 min，4 ℃保存。

1.5 基因型检测

SREBP-1基因PCR扩增产物多肽之间有84 bp的差距，由于该片段特殊的插入或缺失突变，不同基因型的PCR产物由于片段长度不同，电泳时分离速度不同，所以扩增产物可以直接通过琼脂糖凝胶电泳结果进行分型，因此使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，取3 μL PCR扩增产物直接点样，120 V电泳30 min，在凝胶成像仪上观察扩增产物结果分析基因型。选择电泳条带清晰明亮的样品，纯化后检测成功的样本采用BDT试剂盒进行测序反应。依次加入测序酶、缓冲液、引物和纯化后的产物，上PCR仪进行扩增，扩增后产物进行纯化。采用酒精纯化法，纯化后的产物加入高度去离子甲酰胺混匀，使用ABI 3730xl DNA Analyzer测序，比对测序结果验证是否存在84 bp的碱基差异。

1.6 脂肪酸组成和含量测定

参照简路洋等[17]方法进行血液样品的前处理和脂肪酸的提取、皂化与酯化处理。使用美国Agilent公司产气相色谱-质谱联用仪(7890A-5975C)及Supelco SPTM-2560气相毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)分析脂肪酸组成和含量。在上述操作条件下，测定37种脂肪酸甲酯混合标准品，以对不同脂肪酸组成的保留时间进行定性。采用面积归一化法，通过测定相应峰面积对所有成分峰面积总和的百分数来计算每个脂肪酸的含量，用百分比表示。

1.7 数据处理

试验数据采用Excel 2010软件进行整理，数据分析采用SPSS 25.0对脂肪酸含量和基因相对表达量进行独立样本t检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)和皮尔逊(Pearson)相关分析。

2 结 果

2.1 高寒草原饲养西门塔尔牛血液SREBP-1基因相对表达量和主要脂肪酸含量的显著性分析

血液样品中共测得36种脂肪酸，其中饱和脂肪酸(SFA)17种，MUFA 8种，多不饱和脂肪酸(PUFA)11种。高寒草原饲养西门塔尔牛血液SREBP-1基因相对表达量和主要脂肪酸含量的显著性分析结果如表1所示，在高寒草原饲养的西门塔尔牛血液中SREBP-1基因相对表达量为0.20%；SFA和MUFA含量分别为38.65%和25.42%，MUFA/SFA为0.67。SFA中棕榈酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)含量较高，分别为12.57%和21.76%；MUFA中油酸(C18∶1)含量最高，为22.11%；PUFA中亚油酸(18∶2)含量最高，为29.53%。SREBP-1基因相对表达量对西门塔尔牛血液脂肪酸中的肉豆蔻酸(C14∶0)、肉豆蔻油酸(C14∶1)、C16∶0、C18∶2和SFA含量以及MUFA/SFA、C14指数、C16指数、C18指数和伸长指数有显著性影响(P<0.05)。

表1 高寒草原饲养西门塔尔牛血液SREBP-1基因相对表达量和主要脂肪酸含量的显著性分析Table 1 Significant analysis of blood SREBP-1 gene relative expression level and main fatty acid contents of Simmental cattle raised in alpine grassland

2.2 高寒草原饲养西门塔尔牛血液SREBP-1基因相对表达量与脂肪酸含量的相关性

对高寒草原饲养西门塔尔牛血液SREBP-1基因相对表达量与C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1和MUFA含量进行相关性分析，结果如表2所示，血液SREBP-1基因相对表达量与16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1和MUFA含量呈正相关，且均无显著性(P>0.05)。

表2 高寒草原饲养西门塔尔牛血液SREBP-1基因表达量与脂肪酸含量的相关性分析Table 2 Correlation analysis between blood SREBP-1 gene relative expression level and fatty acid content of Simmental cattle raised in alpine grassland

2.3 SREBP-1基因分型结果

SREBP-1基因第5内含子区的84 bp插入或缺失，使得不同基因型的PCR产物之间有84 bp的长度差异，因此扩增后的PCR产物可直接通过凝胶电泳根据片段分离距离判断其基因型。如图1和图2所示，经检测发现，该位点存在多态，分别定义为LL基因型(插入型)和LS基因型(杂合型)2种基因型；对LL和LS基因型的PCR扩增产物分别纯化进行测序，结果进行比对发现，SREBP-1基因2条条带确实存在84 bp的碱基差异。

LL：LL基因型 LL genotype；LS：LS基因型 LS genotype。图1 SREBP-1基因分型结果Fig.1 Typing results of SREBP-1 gene

图2 SREBP-1基因型测序比对结果Fig.2 Sequencing comparison results of SREBP-1 genotypes

2.4 SREBP-1不同基因型对高寒草原饲养西门塔尔牛血液脂肪酸组成的影响

对高寒草原饲养的西门塔尔牛血液SREBP-1基因进行分型，共得到2种基因型，分别为LL和LS基因型，其基因型频率分别0.90和.010，L和S等位基因频率分别为0.95和0.05。SREBP-1基因型对西门塔尔牛血液脂肪酸组成的影响如表3所示，C14∶0(0.74%)、C14∶1(0.17%)、C16∶0(15.91%)、C18∶0(23.56%)含量以及C14指数(0.12)均为LS基因型高，C16∶1(1.62%)、C18∶1(22.51%)、C18∶2(29.57%)、SFA(44.54%)和MUFA(25.84%)含量以及MUFA/SFA(0.69)、C16指数(0.12)、C18指数(0.51)和伸长指数(0.76)均为LL基因型高。上述脂肪酸组成在LL和LS基因型基因中均无显著性差异(P>0.05)。

表3 SREBP-1基因型对高寒草原饲养西门塔尔牛血液脂肪酸组成的影响Table 3 Effects of SREBP-1 genotype on blood fatty acid composition of Simmental cattle raised in alpine grassland

3 讨 论

高寒草原饲养的西门塔尔公牛血液SREBP-1基因相对表达量为0.20%。Ohsaki等[18]研究发现SREBP-1基因对黑毛和牛脂肪酸中C14∶0、C16∶0、C14指数和伸长指数均有显著性影响，此结果与本试验一致。同时本试验还发现SREBP-1基因对高寒草原饲养的西门塔尔牛血液中C14∶1、C18∶2和SFA含量以及MUFA/SFA、C16指数和C18指数也有显著性影响。已知SREBP-1基因是SCD1基因的调控因子，SCD1主要作用于C16∶0和C18∶0，使其转化为C16∶1和C18∶1，从而调控MUFA含量[19]。本试验中，血液SREBP-1基因相对表达量与C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1和MUFA含量均呈正相关。有研究发现，SCD1基因相对表达量与C16∶1、C18∶1和MUFA含量有正效应关系[20]。结合本试验结果可初步判断SREBP-1基因和SCD1基因有着共同促进MUFA合成的作用，但仍需后续研究证实。

基因多态性是影响脂肪酸组成的因素之一。本试验样品中SREBP-1基因检测仅到LL基因型和LS基因型2种基因型。Han等[21]检测了225头安格斯杂交牛的SREBP-1基因多态性，未得到SS基因型，与本文研究结果一致。高寒草原饲养的西门塔尔牛SREBP-1基因的L/S等位基因频率在公牛血液中分别为0.950和0.050，在公牛背最长肌中分别为1.000和0.000，在母牛血液中分别为0.986和0.014，母牛背最长肌中分别为0.900和0.100。Hoashi等[15]和Matsuhashi等[22]统计分析了日本黑牛不同群体中第5内含子长度多态的基因频率，L/S等位基因频率分别为0.632、0.368和0.49、0.51，在韩国汉宇牛中L/S等位基因频率分别为0.72和0.28[23]。在Fleckvieh牛群体中，观察到L/S等位基因频率为0.920 3和0.079 7[24]。以上研究均具有较低的S等位基因频率，与本试验结果一致，是牛群体中SREBP-1基因多态性的普遍结果。

SREBP-1基因参与调控脂肪代谢，其对脂肪酸组成也有一定影响。Hoashi等[15]研究日本和牛发现，SS基因型具有更高的MUFA含量。Bhuiyan等[23]报道，LL基因型的韩国汉宇牛的硬脂酸含量分别比LS和SS基因型高5.7%和6.3%。Barton等[24]研究发现，与皮下脂肪中的LL基因型相比，LS基因型的肉豆蔻油酸含量更高。在韩国牛中，LL基因型有较高的硬脂酸含量和较低的亚油酸含量[23]。然而，Matsuhashi等[22]报告，SREBP-1基因多态性对日本黑牛群体的脂肪组织和胸最长肌中的脂肪酸组成没有影响。本试验研究得出高寒草原饲养的西门塔尔牛血液中SREBP-1基因的LL和LS基因型对脂肪酸组成均无显著性影响，与Matsuhashi等[22]研究结果一致。SREBP-1基因多态性与不同肉牛群体脂肪酸的相关性不一致，SREBP-1基因对肉牛脂肪酸组成的影响尚需进一步研究。

4 结 论

① 高寒草原饲养的纯种西门塔尔牛血液中含有丰富的脂肪酸组成，血液SREBP-1基因对C14∶0、C14∶1、C16∶0、C18∶2和SFA含量以及MUFA/SFA、C14指数、C16指数、C18指数和伸长指数均有显著性差异。

② 血液SREBP-1基因相对表达量与C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1和MUFA含量均呈正相关关系。

③ 血液SREBP-1基因在第5内含子84 bp处有插入缺失多态性，表现为LL和LS基因型，2种基因型之间脂肪酸组成均无显著性差异。

④SREBP-1基因可以作为高寒草原饲养下西门塔尔牛品种培育和评估的重要候选基因。