白细胞介素-12抗肿瘤免疫治疗的研究进展△

涂丽英，张李琛，张进萍，邹云莲,#

1昆明理工大学医学院，昆明 650500

2云南省第一人民医院/昆明理工大学附属医院血液疾病临床医学中心，昆明 650032

恶性肿瘤因其高发病率和病死率已成为世界三大疾病之一。肿瘤免疫疗法是应用免疫学的方法，结合多种技术抑制肿瘤生长的新疗法[1]，因其显著的抗肿瘤效应，被列为十大科学突破之首[2]。细胞因子是不同类型细胞之间交流的主要调节因子，由体内多种免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等合成、分泌。它们通过协调各种促炎和抗炎细胞群之间的平衡，参与免疫细胞的增殖、分化和成熟[3]。近些年来细胞因子已经成为肿瘤免疫治疗的热点之一。白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）是IL-12家族中第一个被发现的细胞因子，由于显著的抗肿瘤潜能，已成为近年来肿瘤免疫治疗中研究最为广泛的细胞因子之一。本文从抗肿瘤作用机制及临床转化研究两方面对IL-12的研究进展进行综述，旨为梳理IL-12的前沿研究方向。

1 IL-12的生物结构与功能

IL-12是由p40和p35两个亚基构成的异二聚体，主要由抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）产生。IL-12具有种属特异性，而其种属特异性取决于p35的种类。当p35是鼠源，则无论对鼠还是对人的淋巴细胞，均有增殖作用，但当p35是人源时，只对人淋巴细胞有效应，而p40的种属并不起决定作用。在功能方面，p40刺激CD4+T细胞促进γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）和IL-17的合成和分泌[4]，上调肿瘤相关巨噬细胞的抗肿瘤作用[5]。而p35可以抑制淋巴细胞增殖，诱导IL-10和IL-35表达的B细胞扩增[6]。IL-12常被认为是炎性细胞因子参与机体免疫反应，但是Balasubbramanian等[7]的研究表明IL-12并不是一直为促炎状态，其促炎性或是抗炎性取决于血压。在抗肿瘤研究中，IL-12不仅通过激活被动免疫和天然免疫抑制肿瘤生长，还可通过抑制肿瘤新生血管生成、促进细胞凋亡等方式抑制肿瘤进展。在临床研究中，IL-12常通过单独应用或与多种治疗方式（包括抗体、抗血管生成剂、放疗、过继治疗和抗肿瘤疫苗）联合应用的方式提高疗效，并在动物模型中取得了可观的治疗效果，是近年来肿瘤免疫疗法的研究热点[8]。IL-12本身及其组合的免疫调节和抗肿瘤活性机制仍在探索之中。

2 IL-12的抗肿瘤作用机制及其临床前研究进展

2.1 间接促进相关免疫细胞激活及增殖

细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）活化是机体抗肿瘤免疫反应的首要步骤。CTL细胞间通讯依赖于细胞小泡，尤其是外泌体。Li等[9]研究表明，使用IL-12刺激CTL可以影响外泌体的大小，并导致某些外泌体蛋白的选择性富集，外泌体会使初始CD8+T细胞在不存在抗原的情况下产生IFN-γ和颗粒酶B，并且增强弱抗原刺激对CTL的影响。

自然杀伤（natural killer，NK）细胞是人体重要的天然免疫细胞，它们主要参与识别和破坏被病原体（病毒、细菌和寄生虫）感染的细胞或肿瘤细胞[10-13]。杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）组成主要组织相容性复合体-Ⅰ（major histocompatibility complex-Ⅰ，MHC-Ⅰ）结合受体家族，对调节人NK细胞和部分T细胞的活化阈值起重要作用。Ewen等[14]的研究表明，用IL-12刺激NK细胞会使外周血NK细胞表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体，两个Ig结构域和细胞质长尾2（killer cell immunoglobulin like receptor,two Ig domains and long cytoplasmic tail 2，KIR2DL2）、KIR2DL3、KIR2DL1以及 KIR3DL1表达下调，从而降低了抗体介导的KIR参与的抑制作用，并增加了CD16的依赖性毒性，KIR2DL2/KIR2DL3表达下调的NK细胞对表达同源人白细胞抗原 1（human leukocyte antigen 1，HLA1）分子的肿瘤细胞毒性增强。IL-12主要通过诱导产生IFN-γ促进先天性和获得性细胞介导的免疫反应。IL-12可增强T细胞和NK细胞的细胞毒性，并诱导NK细胞产生IFN-γ，促使吞噬功能增强和局部炎症，并且驱动辅助性T细胞1（helper T cell 1，Th1）型反应和阻碍Th2的分化[15-16]。

效应记忆T细胞（effector memory T cell，Tem）在感染早期可以快速产生针对特定抗原的适应性免疫反应，CD8+T细胞可以通过雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）途径分化为Tem，而MTOR途径与转录因子T-bet和脱中胚蛋白（eomesodermin，EOMES）的表达有关。Wang等[17]的研究证实，利用IL-12可以增强MTOR途径的活性，进而影响T-bet与EOMES转录因子的表达，从而促进CD8+Tem细胞的分化以及IFN-γ表达增加，增强了其抗肿瘤作用。

2.2 直接激活免疫细胞促进抗肿瘤作用

树突状细胞（dendritic cell，DC）是最强有力的APC，能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。彭维[18]的研究证实，IL-12可以使免疫耐受的DC细胞产生抗肿瘤作用，提高DC细胞刺激淋巴细胞增殖以及杀伤肿瘤的能力，但是具体的作用机制尚不明确，可能与促进核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的活化从而上调信号转导及转录激活因子4（signal transduction and activator of transcription 4，STAT4）的表达有关。

单核细胞是肿瘤微环境中巨噬细胞和DC的主要来源。在肿瘤进展过程中，它们通过分化为免疫调节细胞参与肿瘤免疫逃逸。单核细胞可以连接先天性和获得性免疫反应，并可以通过诱导免疫耐受、血管生成和增加肿瘤细胞扩散等各种机制影响肿瘤微环境。马婷婷等[19]的研究表明，用过表达人IL-12腺病毒载体感染THP-1细胞时可促进单核细胞向巨噬细胞分化，这为临床治疗单核细胞白血病提供了新的方向。巨噬细胞可分化成两种常见表型，即M1型和M2型。M2极化的巨噬细胞主要通过诱导精氨酸酶1和IL-10相关网络参与组织重塑、修复和血管生成过程；在泛癌分析中，肿瘤微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞的出现通常与不良预后相关[20]。M1极化的巨噬细胞因表达高水平的炎症介质，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、一氧化氮和活性氧，被归类为抗肿瘤效应细胞，它们能够直接杀死肿瘤细胞并刺激抗肿瘤T细胞反应[21]。吴碧涛[22]通过携载人IL-12的腺病毒证实，过表达IL-12可促使M2型巨噬细胞向M1型转化。此外，IL-12还通过上调肿瘤细胞上的MHC-Ⅰ来促进抗原呈递，有利于M1型巨噬细胞的极化，并通过增强CXC趋化因子配体9（C-X-C chemokine ligand 9，CXCL9）、CXCL10和CXCL11的产生来吸引效应免疫细胞[23-26]。

基因修饰T细胞的能力是许多免疫治疗研究的重要组成部分，但是现阶段的方法都受转染效率的限制。Andrijauskaite等[27]发现，在T细胞培养基中加入IL-12进行7天的预培养后进行T细胞转染实验时，与对照组相比表现出更强的转染效率，这种效率增强可能与IL-12调节B细胞淋巴瘤/白血病-3（B cell lymphoma/leukemia-3，Bcl-3）的mRNA表达有关，这为提高转染效率提供了新的思路。

2.3 利用新载体携载IL-12发挥抗肿瘤作用

在应用IL-12治疗恶性肿瘤的传统治疗方案中，大剂量IL-12直接输注造成的极大机体不良反应严重限制其在临床的应用转化。近年来基因工程载体的迅速发展使得IL-12能借助病毒、质粒、细胞等多种载体将其定点导入肿瘤局部后释放，从而减少不良反应，已成为IL-12临床应用研究的新方向。

嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）是现阶段最常用的新型治疗方法之一，现在已经发展到具有“开关”模块并可以携载相应因子的第五代，只有当T细胞激活时才会分泌相关因子。第五代CAR-T的出现降低了IL-12的全身毒性，并且IL-12又可以促进CAR-T细胞增殖。Kueberuwa等[28]的研究表明，分泌IL-12的CAR-T疗法能够根除免疫健全小鼠中已建立的B细胞淋巴瘤，其长期存活率为25%，并且表达IL-12的CAR-T细胞不仅直接杀死CD19+细胞，而且还将宿主免疫细胞募集到抗肿瘤免疫应答中，这为第五代CAR-T的临床转化研究提供了有利的实验依据。虽然以CAR-T细胞作为载体携载IL-12在动物实验中取得了较好的实验结果，但由于临床应用较少，不良反应尚不明确。

RheoSwitch™系统（RheoSwitch™ system，RTS）是一种新型基因表达控制开关，由多个相互依赖的功能组件组成。该RTS“基因开关”的功能可以由小分子配体Veledimex来控制转基因表达启动子，Veledimex是一种专有的基因疗法启动子系统的口服激活剂配体，是细胞色素P450家族3亚家族A成员4/5（cytochrome P450 family 3 subfamily A member 4/5，CYP3A4/5）的中度抑制剂和底物。在没有Veledimex的情况下，RTS诱导的转基因表达“关闭”，而通过施用Veledimex，转基因表达被“打开”。Barrett等[29]将RTS系统与IL-12联合应用以克服神经胶质瘤的先天免疫抑制，从而通过增加肿瘤细胞毒性T细胞和减少调节性T细胞（regulating T cell，Treg）来达到平衡，从而在原位神经胶质瘤模型中延长生存期并且没有明显的不良反应。在第85天（研究终止时），超过95%的Ad-RTSIL-12+Veledimex处理的动物依旧保持了无瘤状态，这也为RTS系统与IL-12在临床中的联合应用提供了有力证据。

Kułach 等[30]用间充质基质细胞（mesenchymal stromal cell，MSC）作为IL-12的载体来治疗患有原发性和转移性黑色素瘤的小鼠，在给药MSC/IL-12后，小鼠的肿瘤生长受到抑制，转移数量显著减少。MSC/IL-12可降低治疗组小鼠肿瘤血管密度，增加抗肿瘤M1型巨噬细胞和CD8+细胞毒T细胞的数量。MSC是一种有效、安全的IL-12细胞因子载体。Kim等[31]研究表明，在小鼠模型中，共表达IL-12和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF）的溶瘤病毒HSV-1可以引发针对侵袭性和高免疫原性黑色素瘤的抗肿瘤免疫反应，并且与表达单个细胞因子的Δ6/GM或Δ6/IL-12治疗相比，Δ6/GM/IL-12治疗可抑制肿瘤生长并延长生存期。因此，来自工程溶瘤单纯疱疹病毒的IL-12和GM-CSF具有协同作用，可促进免疫反应，增强其抗肿瘤作用。Mansurov等[32]向黑色素瘤小鼠静脉注射融合了IL-12的胶原结合区域（collagen-binding domain fused to IL-12，CBD-IL-12）后，CBD-IL-12诱导肿瘤内持续的IFN-γ水平，显著降低IFN-γ全身水平和器官损害，并显示卓越的抗肿瘤效果。此外，CBD-IL-12与检查点抑制剂（checkpoint inhibitor，CPI）有协同作用，根除了大型已建立的黑色素瘤，诱导了抗原特异性免疫记忆，并控制了黑色素瘤基因工程小鼠模型中的肿瘤生长。CBD-IL-12可加强免疫冷肿瘤的CPI免疫治疗。

3 IL-12的临床研究进展

3.1 IL-12的临床前研究

IL-12首先被证实在黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌以及肉瘤的小鼠模型中具有抗肿瘤活性，后被应用于各种肿瘤模型中。李焱等[33]将急性髓系白血病患者骨髓来源CD34+白血病细胞用IL-12诱导5周后发现，CD34+白血病细胞可在体外诱导分化为NK细胞，且具有杀伤活性，并且TNF-α和IFN-γ基因表达水平也显著增加。Cemazar等[34]结合电化学疗法和IL-12基因电转移治疗犬类肥大细胞瘤，其中72%的犬只在接受治疗后完全缓解（complete response，CR），并且肿瘤体积＜2 cm3的犬只达到100%的CR率。Gao等[35]构建了一种基于两亲性聚磷腈的重组鼠IL-12质粒（pmIL-12）系统递送的多聚体囊泡系统来传递IL-12以避免其全身毒性，结果表明，静脉注射pmIL-12聚合物囊泡可显著抑制携带CT-26结肠癌细胞的BALB/c小鼠的肿瘤生长，这与有效转染pmIL-12聚合体诱导的抗肿瘤免疫反应有关。Shen等[36]对模型小鼠进行化疗以抑制其免疫反应，随后使用IL-12发现，使用化疗对细胞因子产生的抑制作用被解除，并且恢复了CD4+和CD8+T细胞中IFN-γ的表达。多个临床前研究表明，肿瘤注射表达IL-12的载体以及表达IL-12的骨髓DC在小鼠中都没有产生明显毒性，这也使其成为临床前研究和临床研究中应用广泛的细胞因子。Agliardi等[37]研究发现，IL-12不仅能增强CAR-T细胞的细胞毒作用，而且还能重塑肿瘤微环境，促进CD4+T细胞肿瘤浸润，减少Treg的数量，激活髓系细胞。重要的是，IL-12的免疫治疗益处是以最小的全身影响实现的。因此，局部注射IL-12可能是CAR-T细胞治疗多形性胶质母细胞瘤的一种有效辅助手段。

3.2 IL-12的临床研究

IL-12在临床前的广泛研究及显著疗效促使其向临床研究快速转化。目前，IL-12常与CAR-T细胞或者其他疗法联合应用来治疗恶性肿瘤。Zhang等[38]利用诱导分泌IL-12的质粒（NFAT）改造了人类肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL），给予33例转移性黑色素瘤患者剂量递增的注射治疗，其中有11例患者通过实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）评价为客观缓解，在接受0.1×109或更少细胞治疗的17例患者中，仅观察到1例患者（5.9%）客观缓解，与较低细胞剂量下的结果相反，用（0.3～3.0）×109NFAT-IL-12细胞培养物治疗的16例患者中有10例（62.5%）表现出客观缓解（P=0.0008）；9例患者表现出部分消退，但是这些患者中只有2例持续进行治疗（12个月和27个月），1例患者表现出完全消退。这表明使用更高数量级的NFAT-IL-12-TIL细胞注射治疗可以有效提高自体细胞移植（autologous cell transplantation，ACT）的有效性，这为后续的临床试验提供了有效数据。Koneru等[39]在一项正在进行的Ⅰ期临床试验中，使用剂量递增的方式，首次将分泌IL-12的MUC16-CAR-T细胞通过腹膜直接注射到了人腹部的卵巢癌病变部位。You等[40]构建了一种包含SM3单链可变片段（scFv）序列的CAR-T细胞，该序列专门靶向MUC1抗原并共表达IL-12（SM3-CAR）以及一种携带经修饰的SM3 scFv序列但未表达IL-12的CAR-T细胞系（pSM3-CAR）。然后将这两种类型的CAR-T细胞瘤内注射到同一MUC1阳性的精囊癌患者的两个独立转移性肿瘤中，初步结果表明，靶向MUC1的CAR-T细胞方法无不良反应，并且患者血清细胞因子反应为阳性，进一步评估表明，pSM3-CAR有效导致了肿瘤消退。但近两年的相关临床试验数据大多并未公开，暂无法获取更多临床试验数据。近年来开展的应用IL-12治疗恶性肿瘤的相关临床研究详见表1。

表1 IL-12治疗恶性肿瘤的相关临床研究

4 小结与展望

IL-12是肿瘤免疫治疗中重要的细胞因子，具有较强的抗肿瘤作用，不仅可以调节Th细胞的平衡，促使DC细胞成熟，促进CIK细胞增殖并增强其杀伤能力，诱导NK细胞产生，还可以以CAR-T细胞作为载体或者与其他疗法联合应用治疗恶性肿瘤。多种IL-12递送系统在临床前模型中已经证明了强大的抗肿瘤效应并可减少不良反应的发生，分子工程方法在有效性和安全性方面改进了IL-12的治疗效果。目前，治疗恶性肿瘤依然是一个巨大的挑战。虽然IL-12是一种效应性细胞因子，可在肿瘤部位招募各种效应性免疫细胞，但它也可能诱导炎症反应。因此，未来的研究，特别是涉及临床试验的研究，在将IL-12用于肿瘤患者的免疫治疗时，应考虑与其相关的炎症反应，不断完善IL-12与新型平台结合的技术，保持免疫细胞的持久性、功能活性，以更好地应用于肿瘤的临床治疗中。