姜黄素对尿道瘢痕成纤维细胞的放疗增敏作用及其机制*

邓 骞，田永峰，段万里，陈 鑫，潘思源，任 伟， 杜 春△

(1.陕西省人民医院泌尿外科，西安 710068；2.西安医学院，西安 710021；3.陕西省人民医院放疗科，西安 710068)

尿道狭窄是泌尿外科常见疾病，其治疗一直是泌尿外科中的一个难点。孙颖浩院士团队将放疗运用于尿道狭窄的预防和治疗，取得了较好的疗效，治愈率达到82%[1]，笔者前期的研究也同样证实了这一疗效[2]。尽管腔内放疗在尿道狭窄的治疗上具有一定的安全性，但较大剂量的放射线不仅有导致尿道狭窄复发的可能性，而且存在潜在诱发肿瘤的风险[3-4]。姜黄素是一种被广泛研究的放疗增敏剂，有研究认为姜黄素具有抗纤维化、抑制胶原蛋白产生的作用[5]，但目前暂无学者研究姜黄素是否对尿道狭窄的放疗具有增敏作用。本文拟在体外实验中验证姜黄素是否能作为放疗增敏剂抑制尿道瘢痕成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的合成，并初步探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

男性尿道狭窄瘢痕段切除术后标本，标本及资料收集均经患者本人知情同意，本研究获得医院伦理学委员会批准通过；姜黄素购自美国Sigma-Aldrich公司；重组人转化生长因子β1(TGF-β1)购自美国R&D公司。蛋白CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自北京全式金生物公司；细胞周期检测试剂盒及TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；抗波形蛋白抗体、抗Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白抗体、抗TGF-β1抗体购自英国Abcam公司；抗β-actin抗体、辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗、FITC偶联二抗购自北京全式金生物公司。

1.2 方法

1.2.1尿道瘢痕成纤维细胞的分离及培养

按照屈卫星等[6]所述方法，将组织块标本于含有抗生素的PBS液中反复冲洗，去除多余的上皮组织；将组织标本分解为5 mm×5 mm大小的组织小块并适当向组织上滴加培养基使其保持湿润。送入离心管中，加入0.25%胰酶消化液-EDTA和胶原蛋白酶-Ⅰ，在37 ℃恒温水浴箱中消化4～5 h，每小时振荡1次。将混悬液匀速滴加在烧杯上滤网进行过滤，取滤过后的混悬液170.2×g离心5 min；弃去上清液，加入6 mL的新鲜培养液，充分吹打细胞，于细胞培养箱中37 ℃、5% CO2培养。次日绝大部分成纤维细胞已贴壁，换细胞培养基，每隔2～3 d给细胞换液1次。最终有1例标本的尿道瘢痕成纤维细胞被成功分离并培养。选择波形蛋白作为成纤维细胞的标志物进行检测[7]。

1.2.2放疗方法

使用160千伏X射线机在室温下对细胞进行照射。细胞距离放射源100 cm，剂量率为2 Gy/min，在局部照射装置的辅助下，照射野尺寸为40 cm×40 cm。

1.2.3CCK-8法检测细胞增殖能力

将细胞接种至96孔板，(1～5)×104/孔，于37 ℃、5% CO2培养箱内贴壁24 h。根据需求将细胞分组，每组均设6个复孔。24 h取出96孔板，于显微镜下观察，并加入CCK-8试剂，孵育2 h；酶标仪检测450 nm处吸光度(A)值，并记录结果。

1.2.4平板克隆实验

将1×103个尿道瘢痕成纤维细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁后弃培养液，根据需求加入新的培养液或不同浓度的姜黄素处理细胞2 h，暴露于不同剂量的放射线照射，继续培养24 h，更换新的培养液继续在孵箱中孵育10～14 d。弃培养液，洗涤、固定及染色后，计数各孔集落数(≥50个细胞为1个集落)。

1.2.5流式细胞术检测细胞周期

将尿道瘢痕成纤维细胞接种在6孔板中，待细胞长至70%～80%，根据需求加入新的培养液或不同浓度的姜黄素处理细胞2 h，暴露于不同剂量的放射线照射，继续培养24 h。按照细胞周期检测试剂盒说明书处理并收集细胞后，采用流式细胞术检测各组细胞各周期所占比例。

1.2.6TUNEL法检测细胞凋亡

将20 mm×20 mm盖玻片置于6孔板内，将尿道瘢痕成纤维细胞接种在6孔板中，待细胞长至70%～80%，根据需求加入新的培养液或不同浓度的姜黄素处理细胞2 h，暴露于不同剂量的放射线照射，继续培养24 h，取出盖玻片，按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒处理，并用DAPI复染，封片后荧光显微镜下观察结果并拍照。

1.2.7Western blot定量分析蛋白表达

将尿道瘢痕成纤维细胞接种在6孔板中，待细胞长至70%～80%，根据需求加入新的培养液或不同浓度的姜黄素处理细胞2 h，暴露于不同剂量的放射线照射，继续培养24 h。胰酶消化后将收集的细胞离心并重悬于裂解缓冲液中。冰上孵育30 min 后，提取澄清匀浆 4 ℃、12 000 r/min离心20 min。BCA 蛋白定量试剂盒检测各组蛋白浓度。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，200 mA 湿转120 min，室温下使用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入相应稀释比例的一抗孵育过夜，洗膜后室温下孵育二抗1 h，化学发光法显影，化学发光成像系统观察并拍照。Quantity One图像分析软件分析灰度值，计算出样本蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 尿道瘢痕成纤维细胞的鉴定

细胞以类梭形和排列较为紧密的扁平状细胞为主。波形蛋白免疫荧光染色显示细胞质均呈绿色荧光，波形蛋白表达呈阳性，见图1。

图1 尿道瘢痕成纤维细胞的鉴定(×200)

2.2 不同浓度姜黄素对尿道瘢痕成纤维细胞增殖的影响

随着姜黄素浓度的增加，尿道瘢痕成纤维细胞增殖率降低，见图2。姜黄素作用24 h IC20=19.49 μmol/L，IC50=45.92 μmol/L；48 h IC20=13.68 μmol/L，IC50=30.43 μmol/L。根据放疗增敏剂的选择原则，选取接近IC20的20 μmol/L姜黄素作用24 h作为放疗增敏条件。

图2 不同浓度姜黄素对尿道瘢痕成纤维细胞增殖的影响

2.3 姜黄素对抑制尿道瘢痕成纤维细胞具有放疗增敏作用

姜黄素联合放疗的细胞生存分数低于单纯放疗(P<0.05)，姜黄素对尿道瘢痕成纤维细胞具有放疗增敏作用(SER=2.030)，见图3。根据细胞生存分数，选择较接近IC50的5 Gy作为后续试验的放射剂量。20 μmol/L姜黄素+5 Gy放疗组细胞克隆数低于其他3组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图3 姜黄素对尿道瘢痕成纤维细胞的放疗增敏作用

A：对照组；B：20 μmol/L姜黄素组；C：5 Gy放疗组；D：20 μmol/L姜黄素+5 Gy放疗组；E:各组细胞克隆数比较。图4 姜黄素联合放疗对尿道瘢痕成纤维细胞克隆形成的影响

2.4 姜黄素联合放疗对尿道瘢痕成纤维细胞周期分布的影响

与对照组相比，20 μmol/L姜黄素组S期、5 Gy放疗组G2/M期细胞比例大幅度增加(P<0.001)。姜黄素和放射联合处理后，G2/M期细胞比例进一步增加，而S期细胞比例则处于两者之间，见表1、图5。

表1 各组尿道瘢痕成纤维细胞周期分布

A：对照组；B：20 μmol/L姜黄素组；C：5 Gy放疗组；D：20 μmol/L姜黄素+5 Gy放疗组。图5 姜黄素联合放疗对尿道瘢痕成纤维细胞周期分布的影响

2.5 姜黄素联合放疗对尿道瘢痕成纤维细胞凋亡的影响

对照组、20 μmol/L姜黄素组、5 Gy放疗组、20 μmol/L姜黄素+5 Gy放疗组细胞凋亡比例分别为(6.54±1.01)%、(16.17±2.28)%、(12.88±2.06)%、(24.92±2.65)%，20 μmol/L姜黄素+5 Gy放疗组细胞凋亡比例明显高于其他3组，差异有统计学意义(P<0.001)，见图6。

图6 姜黄素联合放疗对尿道瘢痕成纤维细胞凋亡的影响(×200)

2.6 姜黄素联合放疗对尿道瘢痕成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和TGF-β1的影响

20 μmol/L姜黄素+5 Gy放疗组细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和TGF-β1表达明显低于对照组(P<0.001)，经TGF-β1处理过的细胞Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白合成增加(P<0.001)，见图7。

A:各组细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和TGF-β1的表达；B:细胞经TGF-β1干预后Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白表达的变化；*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.05，与其他组比较；△：P<0.05。图7 姜黄素联合放疗对尿道瘢痕成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和TGF-β1的影响

3 讨 论

尿道狭窄的病因多样，创伤和医源性损伤已成为尿道狭窄最主要的原因。有研究表明，医源性尿道狭窄的比例已达45%[8]。尿道狭窄已成为所有尿道和经尿道手术不得不面对的常见并发症。尿道狭窄目前的治疗方法，如尿道扩张、尿道内切开及开放手术等，均面临尿道狭窄再复发的问题，需多次手术治疗，往往使病变更加复杂化，治疗效果较差。因此，尿道狭窄需要新的治疗方法。

早在1906年，BEBEURMAN等就报道采用X射线能有效治疗皮肤瘢痕疙瘩。而到1976年，LEVY等[9]术后应用放疗有效预防术后瘢痕的产生。进入21世纪，血管内介入放疗发展迅速，MALHOTRA等[10]运用铱-192血管内放疗可明显降低冠状动脉支架植入术后再狭窄的发生率。基于这些研究，孙颖浩院士将腔内放疗应用于尿道狭窄的防治，并取得了满意的效果[11]。国外也有多项研究取得了类似的效果[12-13]。多数研究的总放射剂量为10～20 Gy，尽管这一剂量被认为不会影响正常组织愈合[14]，但仍有学者认为它可能存在导致尿道狭窄[15]、尿道瘘[16]甚至诱发肿瘤[17]的潜在风险。因此，在不影响疗效的前提下尽量减少放射剂量是腔内放疗防治尿道狭窄的关键。放射增敏剂是一种化学或药物制剂，当与放疗同时应用时可以改变目标细胞对放射的反应性，从而增加对目标细胞的杀伤效应，减少放射剂量。

姜黄素是一种从姜黄中分离出来的低分子质量多酚类化合物。随着对姜黄素研究的日益深入，已发现其具有抗炎、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗凝、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等广泛的药理活性，且毒性低、不良反应小[18]。目前已有大量研究证实姜黄素在肝脏、肾脏、肺等器官中均具有明显的抗纤维化作用，主要通过促进成纤维细胞凋亡、自噬等实现[19]。另一方面，许多研究者发现姜黄素可以阻滞肿瘤细胞的细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡，对于多种肿瘤具有放疗增敏作用，而对正常细胞则通过抗炎作用发挥其放疗保护作用[20]。但姜黄素在尿道瘢痕导致的尿道狭窄中尚无相关研究。根据其抗纤维化作用及放疗增敏作用，笔者推测姜黄素可能对尿道瘢痕成纤维细胞也具有放疗增敏作用，能协同放疗抑制尿道瘢痕成纤维细胞的增殖。

在尿道瘢痕的形成过程中，成纤维细胞的过度增殖及胶原蛋白合成的异常增多是其主要病理改变，其中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白是其主要胶原蛋白类型[3]。在众多胶原蛋白合成的信号通路中，TGF-β1通路是其中最重要的一条。由于各种外界因素刺激导致的TGF-β1水平上升，活化TGF-β1/Smad通路，促进相关基因的转录及Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成[21]。因此，笔者推测姜黄素联合放疗可能通过抑制TGF-β1通路来减少Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成。

本研究显示，在体外实验中姜黄素能作为放疗增敏剂，联合小剂量放疗抑制尿道瘢痕成纤维细胞的增殖，并通过TGF-β1通路抑制Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白的合成。这些实验结果表明，姜黄素联合放疗能抑制成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的产生，可能对尿道瘢痕的形成具有一定的抑制作用，有望成为尿道狭窄防治的一种新方法。虽然体外实验已有初步结果，但还需要体内实验来验证其疗效，其作用的分子机制也有待进一步实验来探讨阐明。