白果内酯对早产仔鼠WMI的改善作用及其机制*

姚 娟，赵 旸，李 娜，秦 霞，赵 剡

(1.湖北医药学院附属十堰市人民医院新生儿科，湖北十堰 442000；2.湖北医药学院附属十堰市人民医院儿科，湖北十堰 442000；3.武汉大学中南医院急诊科，武汉 430071)

随着早产儿成活率的上升，幸存的早产儿脑损伤问题日益突出。脑室周围白质损伤(white matter injury，WMI)是最主要脑损伤，不但会增加早期病死率，还可诱发诸多后遗症，已成为新的公共卫生与社会问题[1]。据报道[2]，WMI可影响少突胶质细胞的正常分化、成熟，致大脑发育不良，是早产儿神经功能发育障碍的主要病因。目前国内外尚缺乏早产儿WMI的有效防治策略，故探讨早产儿WMI的发生机制，寻找神经保护药物尤为迫切。白果内酯是银杏叶提取物中唯一一种倍半萜内酯化合物，具有抗氧化应激、保护线粒体功能、抗兴奋性毒性等作用，被广泛应用于缺血性脑中风、阿尔兹海默症等脑神经损伤疾病治疗。关婷等[3]证明以白果内酯为主要成分的中成药可用于改善神经功能缺损。但白果内酯在早产儿WMI治疗中的作用及其机制尚不清楚，故本研究制作早产仔鼠WMI模型，观察白果内酯对仔鼠WMI的改善作用及其可能机制，为临床治疗早产儿WMI提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

7周龄SPF级Wistar大鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司，雌性18只，体重(230±10)g，雄性6只，体重(210±10)g，生产许可证号SCXK(京)2019-0010。实验开展前适应性饲养1周，饲养室温(23±2)℃，相对湿度40%～60%，12 h自然光照，自由摄食饮水。本实验操作符合一般动物实验伦理学原则。

1.1.2主要试剂和仪器

白果内酯(HPLC≥98%，成都格利普生物科技有限公司)。O4抗体免疫组化试剂盒(上海赫澎生物科技有限公司，生产批号：20190506)，兔抗大鼠Ras同源基因家族成员A(RhoA)、磷酸化RhoA(p-RhoA)、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)、重组人轻链Ventricular肌球蛋白2(MLC2)、磷酸化MLC2(p-MLC2)、β-actin一抗(上海钰博生物科技有限公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(上海碧云天生物技术有限公司)。GE ImageQuant LAS 500-生物分子成像仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1造模及分组

适应性饲养结束后，将3只雌性大鼠与1只雄性大鼠同笼饲养，每天早上检查雌性大鼠阴栓，从孕鼠中取12只建立WMI模型[4]：在雌性大鼠出现阴道栓后第16、17天注射脂多糖350 μg/kg，每天1次，同时取6只孕鼠注射等体积生理盐水。将造模孕鼠孕期≤21 d分娩的仔鼠定义为早产WMI，分为模型组、白果内酯组、激动剂组，每组12只。将6只孕鼠足月(22～23 d)分娩的仔鼠作为对照组(10只)。4组仔鼠均与雌鼠同笼饲养，仔鼠出生3 d后开始干预，白果内酯组、激动剂组分别腹腔注射白果内酯3.5 mg/kg、Rho/ROCK通路激动剂LPA 50 μg/mL+白果内酯3.5 mg/kg干预，模型组、对照组腹腔注射等体积生理盐水，连续干预2周。

1.2.2仔鼠神经行为学测定

仔鼠干预2周后，采取悬吊实验、斜坡实验、旷场实验检测仔鼠神经行为学。悬吊实验：让仔鼠前腿抓住一根水平玻璃棒(直径0.5 cm)，离开桌面45 cm，记录仔鼠掉下时间，计分标准：<10 s计1分，10～30 s计2分，>30 s～2 min计3分，>2～5 min计4分，>5 min计5分。斜坡实验：仔鼠头朝下倒置45°斜面上，记录其转位为头朝上角度>135°的时间。旷场实验：用装置为36 cm×36 cm×36 cm的纸箱，无顶，箱底以墨线分成9个等面积小方格，将仔鼠置于中间方格上，观察其15 s内活动情况，从所在方格中进入相邻方格计1分，累计仔鼠15 s进入方格数并记录总分。

1.2.3HE染色观察仔鼠侧脑室面积及脑白质病理学

干预2周后，麻醉断头处死并取出全脑组织，一部分冻存于-80 ℃待Western blot检测，另一部分石蜡包埋，制作6 μm厚的冠状脑片。HE染色：脱蜡水化后，切片浸入苏木素液中染色细胞核，分化返蓝后，浸入伊红液中染色细胞质，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。显微镜观察脑组织形态，Image J软件量化全脑及左、右脑室面积，侧脑室指数(%)=左右脑室面积之和/全脑面积×100%。

1.2.4免疫组化法检测仔鼠少突胶质细胞凋亡情况

冠状脑片脱蜡水化，参考O4抗体免疫组化试剂盒说明书操作：用3%过氧化氢溶液置于玻片上进行热修复抗原，封闭玻片后，加兔抗仔鼠O4抗体(1∶500稀释)，37 ℃孵育1 h，加生物素标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育0.5 h，DAB显色，显微镜下随机选取3个视野，用Image J软件观察阳性信号。

1.2.5Western blot检测仔鼠脑组织Rho/ROCK通路相关蛋白表达

取仔鼠脑组织用RIPA裂解液裂解，BCA法定量蛋白浓度，上样后沸水浴变性，取等量蛋白进行SDS-PAGE分离，将目的蛋白转移到PVDF膜。将PVDF膜置入10%脱脂奶粉中封闭2 h，加入兔抗仔鼠RhoA(1∶500稀释)、p-RhoA(1∶500稀释)、ROCK2(1∶500稀释)、MLC2(1∶500稀释)、p-MLC2(1∶500稀释)、β-actin(1∶500稀释)一抗，4 ℃孵育过夜。次日取出PVDF膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 000稀释)，避光反应1 h，加入ECL发光底物显色。Image Quant LAS 4000 mini显影分析目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 仔鼠神经行为学评分

与对照组比较，模型组、激动剂组、白果内酯组仔鼠悬吊实验评分减少、斜坡实验时间增加、旷场实验评分减少(P<0.05)；与模型组比较，激动剂组、白果内酯组悬吊实验评分增加、斜坡实验时间减少、旷场实验评分增加(P<0.05)；与激动剂组比较，白果内酯组悬吊实验评分增加、斜坡实验时间减少、旷场实验评分增加(P<0.05),见表1。

表1 仔鼠神经行为学评分

2.2 仔鼠侧脑室指数

HE染色结果显示：与对照组比较，模型组仔鼠侧脑室面积增大，侧脑室指数升高(P<0.05)；与模型组比较，激动剂组、白果内酯组侧脑室面积减小，侧脑室指数下降(P<0.05)；与激动剂组比较，白果内酯组侧脑室面积减小，侧脑室指数下降(P<0.05)，见图1。

2.3 仔鼠脑白质病理学

对照组仔鼠脑白质染色清晰，结构正常，细胞排列正常，核大而深染；与对照组比较，模型组脑白质染色淡，结构稀疏，细胞排列紊乱，核固缩；激动剂组、白果内酯组脑白质染色、结构、细胞排列等均明显改善，见图2。

A：对照组；B：模型组；C：激动剂组；D：白果内酯组。图1 HE染色观察仔鼠侧脑室扩张情况(×400)

2.4 仔鼠少突胶质细胞凋亡情况

免疫组化染色显示，对照组仔鼠胼胝体、扣带回处O4表达丰富，阳性细胞数多；与对照组比较，模型组仔鼠O4阳性细胞数明显减少；与模型组比较，激动剂组与白果内酯组O4阳性细胞数有所增加,见图3。

A：对照组；B：模型组；C：激动剂组；D：白果内酯组。图2 仔鼠脑白质HE染色(×400)

2.5 仔鼠脑组织Rho/ROCK通路相关蛋白表达

各组仔鼠脑组织RhoA、MLC2蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，p-RhoA、ROCK2、p-MLC2蛋白表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组、激动剂组、白果内酯组p-RhoA、ROCK2、p-MLC2蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组比较，激动剂组、白果内酯组p-RhoA、ROCK2、p-MLC2蛋白表达降低(P<0.05)；与激动剂组比较，白果内酯组p-RhoA、ROCK2、p-MLC2蛋白表达降低(P<0.05)，见表2、图4。

A：对照组；B：模型组；C：激动剂组；D：白果内酯组；→：O4阳性细胞。图3 仔鼠少突胶质细胞凋亡免疫组化(×400)

表2 仔鼠Rho/ROCK通路相关蛋白表达

A：对照组；B：模型组；C：激动剂组；D：白果内酯组。图4 各组仔鼠Rho/ROCK通路相关蛋白电泳图

3 讨 论

WMI为早产儿脑病主要表现形式，对早产儿神经系统正常发育造成极大影响，往往遗留脑瘫、认知及视听功能障碍等后遗症[5]。目前，关于早产儿WMI的发生机制尚不清楚，ALTENDAHL等[6]认为围生期子宫炎症改变了脑白质发育过程，为诱发早产儿WMI的主要因素，故本研究采用腹腔注射脂多糖致子宫炎症的方法。目前国内外对早产儿WMI尚无统一特效治疗标准，探索新的神经保护药物是治疗该病的关键方向。白果是一种药用价值显著的天然植物，药用历史悠久，白果内酯为其主要药效成分，有抗炎、抗血小板聚集等作用，长期用于增强免疫力、防治心脑血管疾病治疗[7-8]。白果内酯已经进入神经系统疾病相关的临床实验研究中，但对早产WMI动物模型研究的数据鲜见。本研究主要从早产仔鼠WMI侧脑室及脑白质病理损伤、少突胶质细胞特殊标记物表达角度，初步探讨白果内酯对早产仔鼠WMI的神经保护作用，为今后临床防治早产儿WMI提供参考。

悬吊实验、斜坡实验、旷场实验为公认的神经行为学检测方法，指标可观，可快速获得数据。悬吊实验可评估仔鼠随意运动能力，斜坡实验评估躯体协调与平衡能力，旷场实验评估仔鼠运动活力。本研究结果显示：与模型组比较，白果内酯组悬吊实验评分增加、斜坡实验时间减少、旷场实验评分增加，提示白果内酯可改善早产仔鼠WMI的神经行为学。侧脑室扩张是WMI主要症状表现，经HE染色观察仔鼠侧脑室与脑白质病理学发现，与模型组比较，白果内酯组侧脑室面积减小，侧脑室指数下降，脑白质结构、染色、细胞核变化等均明显改善，提示白果内酯可抑制WMI症状，减轻WMI。少突胶质细胞是脑白质的主要成分，为轴突提供营养支持与能量，参与维持神经元轴突信号传递与神经功能[9]。CHAVALI等[10]报道，少突胶质细胞凋亡参与了WMI。宫内感染激活胎儿小胶质细胞，介导了细胞因子、补体、白细胞等参与的免疫性炎症，损伤少突胶质细胞前体细胞，抑制了髓鞘形成，从而出现严重WMI。O4为少突胶质细胞前体细胞的生物标记物，在细胞膜上呈阳性表达，早产儿发生WMI时，少突胶质细胞分化过程受阻，可导致O4表达水平下降[11]。本研究通过免疫组化染色检测O4表达水平，评估少突胶质细胞分化程度，结果显示：与模型组比较，白果内酯组仔鼠脑白质O4阳性细胞数增加，提示白果内酯可抑制少突胶质细胞凋亡，可能与其抗炎作用有关。

Rho蛋白是小分子G蛋白，RhoA为Rho家族成员之一[12]。研究表明脑白质髓鞘抑制因子是通过活化RhoA这一共同分子开关信号通路，诱发一系列反应，影响轴突再生，最终损伤脑白质。RhoA为ROCK最早发现的Rho效应物，可能是脑白质轴突生长的抑制性蛋白发挥作用的焦点[13]。ROCK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，为RhoA下游靶效应分子，根据基因编码不同分为ROCK1和ROCK2两种亚型[14]。其中，ROCK2主要表达于大脑皮层、海马椎体神经元，据报道ROCK2在小鼠出生后大脑发育阶段的表达上调[15]。Rho受外界刺激活化后，将活化信号传递到下游靶分子——ROCK后，作用于其底物MLC，直接使其磷酸化，从而调控细胞动态变化。据报道[16]，Rho/ROCK通路异常激活与WMI相关，但多数报道集中于缺血性动物模型中。本研究结果显示：与模型组比较，激动剂组、白果内酯组p-RhoA、ROCK2、p-MLC2蛋白表达降低，其中以白果内酯组上述蛋白表达最低，提示白果内酯可能通过下调Rho/ROCK通路改善早产仔鼠WMI。

综上所述,白果内酯可能通过下调Rho/ROCK通路，抑制少突胶质细胞凋亡，从而减轻早产仔鼠WMI。