活性氧物种荧光探针研究进展*

王博，邓威力，李达谅

（福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117）

1 引言

活性氧物种(Reactive Oxygen Species，ROS)在炎症、信号转导和神经退行性损伤等不同生物学过程中发挥着重要的作用，其浓度异常极易引起的氧化应激和亚硝化应激导致各种疾病。因此，定量测定活性细胞、组织和生物体内ROS的浓度水平是非常重要的。小分子的荧光探针能够用于定量定性分析ROS在体内外的分布情况，且能够对ROS存在的空间和时间进行有效分辨。因此，荧光探针被认为是帮助现代氧化还原生物学突破的一个极好的工具[1]。将荧光探针与影像技术相结合，根据不同细胞器的微环境进行量身定做，实现了亚细胞水平相关生物分子浓度变化的示踪和动态成像检测[2,3]。荧光成像因其高灵敏度、原位观察、实时监测、无创测量和高性价比的性能而被公认为活细胞研究最强大的工具之一[4]。

2 ROS 荧光探针的研究进展

当前，检测ROS含量的方法主要有原子吸收光谱法、高效液相色谱法、质谱法等，这些方法普遍存在消耗时间长、检测方式复杂、灵敏度较低等问题，极大地限制了其实际应用。相比之下，利用荧光探针作为新型的检测手法，拥有着操作简易、灵敏度高、成像速度快、选择性强等优点，在生物医学、生物化学、环境保护等领域广泛应用[5]。

2.1 次氯酸荧光探针的研究进展

次氯酸（HClO）作为生物体内一种重要的活性氧物质， 在免疫防御等生理过程中具有重要的作用。HClO/ClO-能破坏侵入性细菌和病原体，以低浓度调节机体的生理平衡，也能引起生物细胞内蛋白质、胆固醇、核酸等生物分子的氧化。由于ROS合成和抗氧化剂之间的平衡对于维持体内平衡至关重要，故而生物体内一旦产生过量的次氯酸，极易引起骨关节炎、肺损伤、心血管疾病和癌症等各种疾病，尤其在发育早期阶段，过量的HClO/ClO-可能导致长期影响、致畸性甚至死亡[6]。

Xianhui Wang 团队[7]设计并合成了一种以BODIPY为骨架，含有DMTC（HOCl受体基团）的红色荧光探针DM-BDP-OCl。探针本身不具有颜色，这是由于光照诱导富电子的母核向贫电子的4-DMTC苄基吡啶转移电子导致的，探针在与HOCl反应后母核不能向吡啶部分转移电子进而产生红色荧光（图1A）。与其他ROS相比，探针DM-BDP-OCl对HOCl具有良好的特异性和快速反应能力。成像实验表明，探针可直接监测活HeLa和RAW 264.7细胞中外源性和内源性HOCl的波动。

图1 “脱保护”型次氯酸探针

基于双光子荧光探针和远红-近红外区域荧光探针的优点，Guo-Jiang Mao团队[8]研制了一种具有远红-近红外开启信号功能的线粒体靶向双光子荧光探针Mito-TP-ClO。Mito-TP-ClO由三苯基膦阳离子作为线粒体靶向单位，二甲酰肼结构作为ClO-的反应单位组成（图1B）。Mito-TP-ClO表现出高灵敏度、线性范围广和对ClO-的高选择性，由于其良好的双光子特性和红外光发射范围，Mito-TP-ClO展现出不错的性能，包括自身荧光强度低、光敏感程度低和深层组织渗透能力。此外，该实验成功应用该探针检测到细菌感染细胞时的内源性ClO-和炎症小鼠模型中的ClO-，证实Mito-TP-ClO是监测线粒体ClO-和研究次氯酸盐对线粒体影响的有效工具。Xiaojun He 团队[9]以香豆素为荧光团单元，合成了一种用于ClO-检测的比率比色荧光探针CMSH。实验证明，探针对ClO-具有较高的选择性和灵敏度（图1C）。在体外实验中，该探针表现出对ClO-的快速识别能力和灵敏性能，随着ClO-的加入溶液的荧光由绿色迅速变为蓝色，整个过程都伴随着强烈的荧光。此外，CMSH已经成功地作为比率传感器用于低细胞毒性和良好通透性的活细胞、细菌和斑马鱼成像。

急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）是由过量ROS破坏正常生理结构和功能的协调而引起的肺弥漫性炎症性损伤。HOCl的过度生成可能是ALI的重要原因，因此Na He团队[10]开发了一种合成简单、产率高的荧光探针Bcy-HOCl，用于活细胞和体内定量监测和可视化HOCl。探针包含2个部分：一个二甲基硫代氨基甲酸酯基团作为反应单元和一个苯并吲哚菁荧光团作为荧光调节剂（图1D）。Bcy-HOCl具有较高的选择性和灵敏度，表现出对HOCl的特异性荧光增强。采用Bcy-HOCl对ALI细胞模型和ALI小鼠模型中HOCl的变化进行评估，阐明ALI与HOCl之间的关系，结果证明,HOCl水平随着ALI的严重程度明显增加。

Sourav Samanta 团队[11]研发了一种检测阿尔兹海默症（AD，Alzheimer's disease）产生的HOCl荧光探针CM2。非荧光硫酰胺探针CM2在HOCl存在下选择性转化为荧光酰胺探针CM1，具有较高的选择性和灵敏度，且CM2在一定条件下可以与CM1互相转化；OCl-将CM2的硫羰基中的硫原子氧化，随后被水解除去，生成羰基（图2A）。CM1作为荧光开启状态，用于HOCl的体外和体内检测和成像；CM2出色的细胞摄取和血脑屏障穿越能力，使HOCl在细胞环境、野生型和AD小鼠大脑中得到明确的鉴别检测、成像和定量。

图2 其他反应次氯酸探针

Aishan Zheng 团队研发了一种检测限低（90 nmol/L），选择性强，并且能够靶向定位线粒体的近红外次氯酸荧光探针CVS[12]。该探针的设计主要基于光诱导电子转移(PET)原理，以硫醚作为识别位点来检测HOCl，与HOCl反应后硫化物被氧化成亚砜，消除PET效应，使得荧光显著增强（图2B）。实验证明，探针CVS与次氯酸的反应为瞬态反应，能够消除许多不确定的干扰，且反应后荧光迅速增强18倍，荧光变化明显。

研究表明睡眠不足会诱发内质网应激，但关于睡眠不足相关ROS的信息却很少被检测报道。Qineng Xia团队[13]针对相关ROS的捕获，设计了一种新型双光子荧光分子探针JX-1，用于检测活细胞和斑马鱼体内的HClO，实验证明，JX-1探针实时响应速度快，具有较高的灵敏度和针对HClO的选择性（图2C）。此外，探针JX-1具有低细胞毒性和针对内质网的靶向能力的优点，用该探针标记HeLa细胞，细胞呈现出强烈的绿色荧光，伴随着外源HClO的添加，荧光出现出明显的衰减。这些显著的特性使该探针能够用于监测活细胞和斑马鱼体内的外源性和内源性HClO。

Shrabani Saha 团队[14]制备了一种新颖的荧光素加萘二酰亚胺探针FANDI，并通过独特的化学剂量学方法对混合于其他ROS和生物相关离子中的次氯酸盐或氯离子进行了选择性识别，该探针表现出了对次氯酸根离子良好的选择性。由于探针FANDI在其框架中含有荧光素的一部分，它保留了该染料的优点，同时，由于对结构的改造，探针FANDI的荧光性质发生了剧烈的变化，在较宽的pH范围内能够成功激发ClO-的氧化性质并产生强烈的绿色荧光（图2D）。该论文还评价了该探针的细胞通透性、检测特异性和光稳定性，证实其成为一种可靠的细胞内ClO-离子识别和实时监测手段的可行性。

2.2 过氧化氢荧光探针的研究进展

过氧化氢（H2O2）是一种典型的活性氧，主要由存在于几乎所有细胞中的活性三磷酸吡啶核苷酸（NADPH）氧化酶产生的必需氧代谢物，越来越多的证据支持其作为氧化应激的重要标记物和各种生理过程中细胞信号转导的信使的作用[15]。在细胞器水平上，线粒体是产生H2O2的主要部位，在生理和病理条件下，线粒体H2O2在细胞的生存、生长、分化和维持中起着至关重要的作用。然而随着时间的推移，由于氧化应激、基因突变，细胞线粒体中异常产生或积累H2O2与许多人类疾病，如癌症、糖尿病、肥胖、神经退行性疾病和中风密切相关[16]。因此，实时在线监测活体内H2O2水平的变化，对于深入了解生命体氧化还原平衡调控的机制，实现疾病的早期诊断与跟踪治疗具有重要意义。

Jun Liu 团队[17]提出了一个通用和可靠的双猝灭概念设计低本底荧光探针，建立了一种新的检测活癌细胞线粒体内源性H2O2的荧光探针骨架（Mito-FR）并合成了两种荧光探针Mito-FN、Mito-FB结构。该探针骨架同时利用硼酸盐驱动的内酰胺形成和可消除的猝灭部分来降低背景荧光，最终实现50倍的荧光开启响应效率（图3A）。探针骨架Mito-FR包含荧光素骨架、可替换的缓冲基团R、双淬灭基团（内酰胺和4-甲基苯硼酸频哪醇酯）、线粒体的识别基团（三苯基膦），能高效、准确识别线粒体中产生的过氧化氢。

图3 典型的过氧化氢探针

Jialing Han 团队[18]设计了一种结构简单的过氧化氢淬灭型荧光探针BNBD。以4-氯-7-硝基苯并呋唑为荧光团的核心结构，结合特定的芳基硼酸盐作为H2O2反应基团，对H2O2进行特异性检测。芳基硼酸盐能够在弱碱性条件下与H2O2反应生成甲醌，随后整个基团脱去，将核心结构裸露后使其荧光消失（图3B）。该实验考虑到取代基的位置对化合物荧光性能的影响，实验设计了三种邻位、间位、对位取代的芳基硼酸衍生物。实验证明，对位取代的芳基硼酸衍生物BNBD是本研究中合适的选择性关闭荧光探针。体外实验证明，BNBD是一种高灵敏度，低毒性，对H2O2有选择性的高效探针，在细胞实验中，被探针标记的细胞呈现出绿色荧光，加入外源性过氧化氢后，细胞荧光消失。

Wenxin Wang 团队[19]报道了一种基于喹啉-黄嘌呤染料的近红外荧光探针QX-B用于H2O2的成像。探针QX-B在772 nm处有10倍的荧光增强，比一般半菁染料的发射波长（约700 nm）长。QX-B在各种分析物上对H2O2具有良好的选择性（图3C），由于QX-B细胞的细胞毒性较低，在HeLa细胞、HCT116细胞、4T1细胞和斑马鱼中，QX-B对外源性和内源性H2O2进行成像的效果较好。

Hao Han 团队[20]设计并合成了一种比色近红外荧光探针HAA，一种具有乙酰基的杂环芳香胺，用于选择性检测活细胞中的H2O2。该探针具有新颖、结构简单、发射波长长、Stokes位移大、较高的特异性和灵敏度、较低的细胞毒性和良好的生物相容性等优点。该探针使用乙酰作为H2O2的识别基团，由于乙酰基的引入，探针分子内产生了显著的电子推拉现象，促进了分子内电荷转移（ICT），增强了系统荧光。H2O2的识别反应会去除HAA的乙酰基，从而导致ICT的终止，导致随后的荧光猝灭（图3D）。

2.3 过氧亚硝酸盐荧光探针的研究进展

过氧亚硝酸盐（ONOO-）是体内由一氧化氮自由基和超氧阴离子产生的一种重要的生理活化剂，是ROS的常见组成成分。在生物系统中，ONOO-具有较高的氧化和硝化能力，过量的ONOO-的产生会对重要的细胞成分，如蛋白质、脂类、DNA和RNA造成严重的损伤。细胞内异常高水平的ONOO-极易诱导疾病，例如炎症性疾病、心血管疾病、类风湿性关节炎、神经退化性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）、癌症、糖尿病、近视、听力障碍等疾病[21,22]，因此开发能够在生物系统中特异性和敏感地跟踪ONOO-的方法对于了解氧化应激疾病的致病机制以及病理是至关重要的。

Maria Weber 团队[23]以香豆素开发了一系列比率荧光探针，探针CM、探针CE、探针CL，能够选择性、灵敏地检测活性氧ONOO-。香豆素基探针具有良好的光稳定性、大的Stokes位移和高的量子产率。三种比率探针均包含用于检测ONOO-的4-甲基苯硼酸频哪醇酯基团和独特的细胞器靶向组（图4A），其在特定的细胞器中对ONOO-产生的精确定位能够提供更准确的疾病分析。将线粒体、溶酶体和内质网的靶向组引入香豆素支架可以定向检测ONOO-的产生，探针CM能够定向检测线粒体中产生的ONOO-，相对应的探针CE、探针CL分别用于检测溶酶体、内质网中产生的ONOO-，3种比率探针对ONOO-具有较高的敏感性和选择性。

图4 经典的过氧亚硝酸盐荧光探针

Maria L.Odyniec 团队[24]同样以香豆素为核心设计了2种新型探针-药物偶联物，探针CC-RNS和探针Cl-RNS。荧光反应由ONOO-介导，反应首先将4-甲基苯硼酸频哪醇酯脱去，香豆素相应的位点转化为苯酚，同时另一端释放治疗药物（图4B）。CC-RNS和Cl-RNS对过氧亚硝酸盐的检出限分别为0.29 μmol/L和37.2 μmol/L，拥有低检测限的优势，2种探针对ONOO-具有良好的线性范围和选择性，能够有效避免其他ROS的干扰。

Guanyang Wang 团队[25]设计并合成了一种基于三氰基呋喃的近红外荧光探针ACDM-BE，该探针对ONOO-具有快速响应能力、高选择性和高灵敏度。ACDM-BE不仅能够检测活细胞中的ONOO-，还成功检测到活体斑马鱼在炎症状态下ONOO-的表达（图4C）。该团队在实验有效消除生物系统的背景自荧光，确保了ONOO-在活体生物系统中的精确定量检测。

Minghao Ren 团队[26]提出了一种苯并噻唑功能化吡咯宁染料BTP，作为一个红色荧光染料平台用于生物成像应用。由于苯并噻唑基具有吸电子性质，与传统罗丹明相比，BTP在吸收和发射波长上表现出较大的红移（图4D）。不仅如此，BTP在各种溶剂中几乎没有荧光，但在高黏度甘油中荧光强烈，可以作为分子转子来反映黏度的变化，而且还能特异性靶向溶酶体，并在溶酶体黏性微环境的辅助下发出荧光。基于BTP平台，Minghao Ren团队开发了其二氢衍生物探针HBTP，并测试了其对ROS的传感性能。结果表明，HBTP是一种对内源ONOO-具有高选择性的荧光探针，荧光响应速度快，灵敏度高。

Xilei Xie 团队[27]开发了一种单分子双光子荧光探针BTNPO（图4E），该探针对ONOO-在单光子以及双光子体系中均有较好的响应能力，并顺利对阿尔兹海默症进行了分析。该探针可以实现对AD过程中的αβ斑块和ONOO-的双通道响应，利用BTNPO可以通过活细胞和脑组织中两个独立的荧光通道同时鉴别这两种AD病理因子，而不需要多次实验进行分析，减少了额外的实验误差。利用BTNPO，该团队通过双光子成像方式，在活细胞模型和动物模型中，同时观察到αβ斑块和ONOO-的分布和变化，以及它们在AD发病和进展过程中的紧密贴壁和相关性，为AD的发病机理研究以及治疗提供了强有力的分析工具。

2.4 其他ROS荧光探针的研究进展

羟自由基（·OH）作为活性氧（ROS）的一种，与多种疾病密切相关。Liqin Chen团队[28]研究开发了一种基于罗丹明结构的·OH近红外荧光探针RH-EDA（图5A）。RH-EDA探针对·OH具有较高的选择性和灵敏度，不受其他ROS的干扰，RHEDA可用于内源性·OH在活细胞和斑马鱼不同条件下的成像。值得注意的是，RH-EDA可以根据药物刺激下正常细胞和癌细胞的不同·OH水平，来区分高荧光对比度的癌细胞，因此该探针可用于体内监测·OH，提高对·OH相关生物学过程的认识。

图5 经典的羟自由基荧光探针

Xingyu Qu 团队[29]开发了2种探针ox-a、ox-b（图5B），以三苯基膦作为取代基的近红外BODIPY探针，位于BODIPY核心的3,5位。探针ox-a与ox-b均具有较高的选择性和灵敏度，表现出对·OH的特异性荧光增强，且这2种探针具有优异的光学性能，可作为荧光开启化学传感器用于·OH的检测，使·OH触发三苯基膦氧化反应，这2种探针自身的荧光强度可以忽略不计，但在受到·OH的触发后，探针ox-a、探针ox-b均发出强烈的红色荧光，它们的传感特性已被用于研究活细胞图像。

Chenchen Li 团队[30]研究了一种用于内源性NO的双光子荧光探针Lyso-TP-NO，该探针以4-乙基氨基-1,8-萘酰亚胺为双光子荧光团，N-甲基苯胺为反应位点合成。实验证明，Lyso-TP-NO探针本身显示的单光子和双光子荧光强度几乎可以忽略不计。利用芳香仲胺在好氧条件下容易与NO发生N-亚硝化反应的特点，将Lyso-TP-NO转化为Lyso-F-NOP，Lyso-F-NOP在单光子以及双光子的激发下均产生强烈的荧光（图6A）。除此之外，Lyso-TP-NO针对其他ROS/RNS具有一定的选择性和灵敏度。

图6 其他活性氧物种荧光探针

Chen Ling 团队[31]报道了一种基于双氰亚甲基-4H-吡喃（DCM）的新型荧光探针DCM-O3，以丁烯基团作为监测臭氧的识别部分。DCM-O3本身不具有荧光，与臭氧反应后发出红色荧光（图6B），实验证明，该探针对臭氧具有较高的选择性，在最佳条件下，其对臭氧的响应时间可在短内迅速完成。DCM-O3针对荧光强度与臭氧浓度呈现出良好的线性关系，可以通过荧光强度的强弱来对臭氧浓度进行定量分析，此外探针DCM-O3细胞毒性低，并成功地应用于检测在活细胞中的臭氧。考虑到所有这些优点，该探针可以作为研究人员在复杂生物环境中研究臭氧相关疾病的有力工具。

·O2-在维持细胞氧化还原平衡中起着重要作用，而·O2-浓度失衡可导致多种疾病，如神经退行性疾病、关节炎、动脉硬化、肿瘤等，因此，超氧阴离子是机体生理和病理过程中产生的活性氧物种的重要生物标志物[32]。然而，由于·O2-的半衰期短和细胞组织的高自发荧光，对内源性·O2-的原位实时跟踪和监测相对于其他的ROS而言是比较困难的。

Yaru Lu 团队[33]提出使用探针ER-Rs在活细胞、组织和斑马鱼内检测内源·O2-。ER-Rs为开环形态，本身在PBS中不具有荧光，对·O2-具有高灵敏度和选择性的响应。该探针以荧光素为主体，以对甲苯磺酰基作为内质网的定位荧光基团，以三氟甲基磺酰基作为·O2-的响应基团。探针ER-Rs在响应·O2-后，脱去三氟甲基磺酰基，生成具有绿色荧光的产物（图6C）。生物成像实验表明，探针ERRs可作为特异性双光子探针，对活细胞、组织和斑马鱼体内内源性产生的·O2-进行成像。

Shan Jiao 团队[34]设计合成了一种检测细胞内源性·O2-的双光子荧光探针IFP-O2。探针能与·O2-迅速发生反应，产生荧光效应。探针本身不具有荧光，在检测到·O2-后，迅速发出强烈荧光（图6D）。细胞实验也表明该探针具有低毒性和线粒体的靶向能力。实验证明，IFP-O2具有检测内源性·O2-的能力。此外，这篇文章首次提出了一种可用于测量口腔癌Cal-27细胞内源性·O2-的探针，并为监测和评估细胞凋亡提供了一种有前景的工具。

3 结论与展望

用于监测细胞微环境中活性氧物种的有机荧光探针的研究已经取得了较大进展，毫无疑问，ROS荧光探针的开发有助于探索并明确ROS在生物体内发挥的重要作用。为了设计理想的、高效的荧光探针来成像ROS，除了探针本身所具有的敏感性、高效性、低毒性等，还需要考虑以下因素：首先，ROS寿命短、活性高，探针应能够实时监测ROS；其次，应发展具有更深入的组织穿透、更少的光损伤和更低自荧光的近红外或双光子荧光探针以满足生物需求；最后，探索新荧光传感机理是开发高性能荧光探针的关键。

综上，现有的ROS荧光探针已发展到较高水平，能够为研究ROS与疾病之间的相互作用提供有效的工具，但仍需继续深入地探索研究灵敏度更高、组织特异性更好和生物兼容性更好的新一代ROS荧光探针，为ROS相关研究提供更多、更有效的技术手段。