超高效液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱高分辨质谱法测定豆类中的硒代蛋氨酸

贾 玮，马如甜，代春吉，石 琳，莫海珍，2，张 浩，夏曾润，祁 蒙

（1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安710021；3.河南科技学院 食品学院，河南 新乡 453003；4.安康市富硒产品研发中心，陕西 安康 725000）

硒元素（Se）是人体正常生长发育过程中所必需的微量营养元素，通过参与谷胱甘肽氧化酶作用而发挥抗氧化、抗衰老、拮抗有毒有害金属、预防心血管疾病等多种重要的生理调节功能［1-3］。缺硒会导致机体功能障碍，引发各种疾病，如克山病和免疫缺陷疾病等［4-6］。“土壤-植物-机体”循环是人体获取硒的主要途径，植物源食品中的硒形态复杂，分为无机硒和有机硒，硒的不同形态直接影响食品的营养价值及安全性。随着富硒食品中有机硒含量的增加，硒的营养吸收及转化率逐渐增加［7］。植物源食品中有机硒形态包括：硒代氨基酸、硒蛋白、硒多糖、硒多酚等。富硒豆类的种植是富硒产业全产业链高质量发展的重要抓手，作为豆类中有机硒的重要组成，硒代氨基酸的准确定量分析是相关产品精深加工过程中质量控制的关键。

硒代氨基酸的检测方法主要为高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法［8-10］、高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法［11-13］与高效液相色谱-串联质谱法［14-17］。前两种方法均是将富硒食品中硒代氨基酸经强酸消解转化为无机硒，通过与标准物质的保留时间比对实现硒形态的鉴定，无法直接提供有机硒形态结构信息［18］。硒代氨基酸主要包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸等，其中硒代蛋氨酸是目前已知生物利用率最高的硒化合物。已有研究者采用高效液相色谱-串联质谱法对绿豆芽、大豆、麦麸中的硒代蛋氨酸进行了检测，但均是使用三重四极杆质谱，分辨率较低。本研究基于超高效液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱高分辨质谱的数据依赖型扫描模式，建立了豆类中硒代蛋氨酸（SeMet）的检测方法，优化了超高效液相色谱条件及样品前处理条件，并对硒代蛋氨酸的碎裂途径与机理进行了研究。该方法操作简便，分辨率高，准确性及重复性好。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

绿豆（陕西西安，超市）；富硒绿豆、富硒黑豆、富硒红豆（陕西安康，湖北恩施）；三羟甲基氨基甲烷（Tris，分析纯，上海山浦化工有限公司）；浓盐酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；胰蛋白酶、蛋白酶K（Sigma Aldrich 公司）；0.22 μm 微孔滤膜（美国Pall 公司）；乙腈、甲酸、甲酸铵、乙酸、乙酸铵（色谱纯，美国Sigma 公司）；硒代蛋氨酸标准物质（CAS号：3211-76-5，纯度＞97.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

Avnti J-26×PI 型高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter 公司）；Vortex.Genie2T 型旋涡混合器（美国Scientific Industries 公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）；AL204-IC 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SHZ-A 型水浴恒温振荡器（上海跃进医疗器械有限公司）；Ultimate 3000-Q-Exactive 型超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Milli-Q Integral型纯水仪（美国Millipore公司）。

1.3 标准溶液的配制

准确称取硒代蛋氨酸标准品1.0 mg（精确至0.01 mg）于10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈-水溶液（1∶1，体积比）溶解并定容至刻度，得到100 mg/L 的标准储备液，于棕色密闭瓶-20 ℃避光保存。准确移取一定量的标准储备液，用乙腈-水溶液（1∶1）稀释，配制一系列质量浓度的标准溶液。取空白样品，经前处理后得到基质提取溶液，用其逐级稀释硒代蛋氨酸标准储备液，得到一系列质量浓度的基质匹配标准溶液。实验所用标准溶液均现用现配。

1.4 样品前处理

准确称取粉碎后的样品5 g（精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，加入10 mL Tris-HCl（30 mmol/L，pH 7.5）缓冲溶液，涡旋混匀，水浴超声30 min，加入10 mg胰蛋白酶，37 ℃恒温水浴振荡酶解4 h，然后加入10 mg 蛋白酶K，50 ℃恒温水浴振荡酶解4 h，在4 ℃条件下，10 000 r/min 离心20 min。取上清液于离心管中，加入等体积的乙腈，静置10 min 后以10 000 r/min 离心20 min（4 ℃），取上清液，用乙腈-水溶液（1∶1）按体积比1∶3稀释，过0.22 μm微孔滤膜后上机测定。

1.5 分析条件

色谱条件：Hypersil GOLD HILIC 柱（50 mm × 2.1 mm，1.9 μm，美国Thermo Fisher Scientific 公司），流动相A：0.2%（体积分数，下同）甲酸6 mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B：0.2%甲酸6 mmol/L甲酸铵乙腈溶液，pH值为2.86；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；柱温：35 ℃。梯度洗脱程序：0～2 min，95%～80%B；2～4 min，80%～60%B；4～8 min，60%B；8～9 min，60%～95%B；9～10 min，95%B。

质谱条件：电喷雾离子化（ESI），采用正模式；鞘气流速：18 L/min，辅助气流速：3 L/min；毛细管电压：正离子模式3 500 V；离子源温度：350 ℃；毛细管温度：320 ℃。全扫描模式（Full scan）下，分辨率为70 000 FWHM，自动增益控制的目标值（AGC）为1.0×106，扫描范围为m/z70～400，最大注入时间为100 ms。二级扫描方式为全扫描/数据依赖扫描模式（Full MS/dd-MS2），分辨率为35 000 FWHM，自动增益控制的目标值为1.0×105，触发时间（Apex trigger）为3～6 s，动态背景扣除为10.0 s，选择TOP 5 模式。待碎裂的目标分析物相关信息在Inclusion list 中设定，保留时间为4.11 min，质荷比为198.002 78，当待碎裂的离子响应强度达到强度阈值2.9 × 104时，即送往高能碰撞解离池（HCD），在碰撞能量10 eV条件下进行碰撞，得硒代蛋氨酸碎裂片段的质荷比为180.976 46、151.997 53。

2 结果与讨论

2.1 超高效液相色谱条件的优化

本实验选择Hypersil GOLD 柱（100 mm × 2.1 mm，5 μm）和Hypersil GOLD HILIC 柱（50 mm × 2.1 mm，1.9 μm）两种不同选择性的色谱柱进行硒代蛋氨酸的分离。Hypersil GOLD 色谱柱的固定相为键合长链烷基的多孔硅胶，载碳量为10%，疏水性较强；Hypersil GOLD HILIC 色谱柱的固定相为强亲水性的极性吸附剂，载碳量为6%。结果表明，Hypersil GOLD HILIC 色谱柱对硒代蛋氨酸的保留能力比Hypersil GOLD 色谱柱强，且目标化合物的色谱峰响应值较Hypersil GOLD 色谱柱高（图1）。因此，本实验选择Hypersil GOLD HILIC色谱柱做进一步的优化实验。

图1 硒代蛋氨酸经不同色谱柱及流动相分离的色谱峰响应值（n=6）Fig.1 Peak response values of selenomethionine separated by different chromatographic columns and mobile phases（n=6）

流动相携带待测物质经色谱柱分离后进入质谱，在去溶剂的同时形成带电离子，因此流动相组成不仅会影响目标物的保留时间和峰形，还会影响离子化效率及响应值［19］。实验考察了不同的流动相缓冲体系对硒代蛋氨酸分离效果、峰形及响应强度的影响。对比了4 种不同的流动相缓冲体系，分别为0.2%甲酸+4 mmol/L 甲酸铵+水/乙腈溶液、0.2%甲酸+6 mmol/L 甲酸铵+水/乙腈溶液、0.2%甲酸+8 mmol/L 甲酸铵+水/乙腈溶液、0.2%乙酸+6 mmol/L 乙酸铵+水/乙腈溶液。结果显示，以0.2%甲酸6 mmol/L 甲酸铵+水/乙腈溶液为流动相时，硒代蛋氨酸的分离效果最佳，峰形尖锐且不拖尾，响应值最高（图1）；使用其他流动相缓冲体系时存在峰前沿、峰拖尾、峰宽等问题。因此，本实验选择0.2%甲酸6 mmol/L甲酸铵水溶液和0.2%甲酸6 mmol/L甲酸铵乙腈溶液作为流动相。

2.2 样品前处理条件的优化

硒代蛋氨酸在豆类中主要以结合形式存在，本研究采用酶解法进行提取。以富硒黑豆中提取的硒代蛋氨酸的色谱峰面积为指标，考察了胰蛋白酶、蛋白酶K 及两者共同使用对样品中硒代蛋氨酸提取效果的影响。胰蛋白酶与蛋白酶K 均归类于丝氨酸蛋白水解酶，胰蛋白酶作用于碱性氨基酸残基的羧基侧，蛋白酶K 的切割活性较广，作用于芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸的羧基端［20］。实验结果显示，采用两种酶共同作用于样品，可断裂多肽链中所有种类的氨基酸，使硒代蛋氨酸更好地游离，得到的色谱峰面积最高，提取效果最优。

2.3 硒代蛋氨酸的断裂途径与机理研究

实验对硒代蛋氨酸进行了碎裂片段机理研究，硒代蛋氨酸的dd-MS2扫描谱图如图2A 所示。在ESI正离子模式下，硒代蛋氨酸加氢后形成偶电子离子［21］，分子离子峰为m/z198.002 78［M+H］+，其主要碎裂途径如图2B所示。电荷中心位于N原子上的分子离子脱去1分子NH3后形成碎片离子C5H9O2Se+，m/z为180.976 46；或脱去1分子CO，1分子H2O后形成碎片离子C4H10NSe+，m/z为151.997 53。电荷中心位于Se原子上的分子离子经γ-H重排后，脱去1分子C3H7NO2形成碎片离子C2H5Se+，m/z为108.955 60；或由正电荷中心引发i断裂反应后形成碎片离子C4H8NO2+，m/z为102.055 55。

图2 硒代蛋氨酸的四极杆静电场轨道阱质谱图（A）及碎裂机理示意图（B）Fig.2 UHPLC/ESI-Q-Orbitrap mass spectrum（A）and fragmentation mechanism（B）of selenomethionine

2.4 基质效应

豆类为复杂基质，富含的蛋白质与脂肪等成分会对硒代蛋氨酸的检测产生干扰。本实验通过绘制溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线来判断基质效应（ME）的强弱。ME=（1-基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率）×100%。ME 绝对值在20%以内为较弱基质效应，在20%～50%为中等强度的基质效应，在50%～100%为强基质效应。通过计算得基质效应为15.75%，表明基质效应较弱，因此本实验通过基质匹配标准校正法进行定量分析，以减弱基质效应对检测结果的影响。

2.5 线性范围、检出限与定量下限

取空白样品，添加0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 系列水平的硒代蛋氨酸标准溶液，按“1.4”方法进行前处理后上机测定，以目标物的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制基质加标工作曲线，得到本方法的线性范围、线性方程及相关系数；再分别以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）确定检出限（LOD）及定量下限（LOQ）。结果显示，硒代蛋氨酸在0.05～0.5 mg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）为0.997 6，LOD和LOQ分别为0.015 mg/kg和0.05 mg/kg。

2.6 准确度及精密度

取空白样品，分别在0.1、0.2、0.4 mg/kg 3 个水平下进行加标回收实验，按照“1.4”方法处理后上机测定，每个加标水平每日平行测定6 次，连续测定6 d。结果显示，硒代蛋氨酸在3 个加标水平下的回收率为77.6%～83.2%，日内相对标准偏差（RSDr）为2.8%～4.8%，日间相对标准偏差（RSDR）为4.1%～6.5%（表1），表明本方法的准确度和精密度良好。

表1 绿豆中硒代蛋氨酸的回收率与相对标准偏差Table 1 Recoveries and relative standard deviations for selenomethionine in mung bean

2.7 实际样品的测定

采用本方法对产自陕西安康、湖北恩施的富硒豆类进行检测，得到富硒黑豆、富硒红豆、富硒绿豆中硒代蛋氨酸的含量分别为0.252、0.163、0.184 mg/kg。图3为富硒黑豆中硒代蛋氨酸的色谱图。

图3 富硒黑豆中硒代蛋氨酸的色谱图Fig.3 Chromatogram of selenomethionine in selenium-enriched black bean

3 结 论

本研究建立了基于超高效液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱高分辨质谱技术的豆类中硒代蛋氨酸的检测方法，对超高效液相色谱条件和样品前处理条件进行了优化，并对硒代蛋氨酸的碎裂机理进行了研究。方法学考察及实际样品检测结果显示该方法的基质效应小，准确度和精密度良好，能够满足豆类中硒代蛋氨酸的检测需求，有助于推动富硒产业的高质量发展。