蛋氨酸对青春期小鼠乳腺发育的影响及机制

李 峰，杨占清，周博文，曹 宇，李 雯，葛玉松，付守鹏，柳巨雄* (.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 3006；.天津嘉立荷唐山牧场，河北 唐山 063099)

乳腺是哺乳动物分泌乳汁以哺育后代的唯一器官，其发育程度决定了仔畜的生长状况。乳腺的发育主要受体内激素水平的影响[1]，其发育阶段可分为胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和退化期[2]。乳腺的基本结构自出生时发育完成，随后一直到青春期，乳腺的发育基本保持静止。进入青春期后，随着激素水平的升高， 乳腺上皮细胞(MECs)和乳腺终末端乳芽迅速增殖，乳腺导管进入脂肪垫形成分支，初步组成导管网络[3-4]。随后，乳腺导管在妊娠期进一步发育形成腺泡样结构，逐渐具备泌乳性能直到泌乳结束。泌乳结束后乳腺进入退化期，腺泡结构开始退化，失去泌乳功能[5-6]。乳腺的状态随着动物的妊娠呈周期性变化[7]。由乳腺的发育进程可知，青春期乳腺的发育程度决定了乳腺在泌乳期分泌乳汁的能力[8]。因此，青春期是乳腺发育的关键时期，对雌性哺乳动物哺育后代尤为重要。

MECs是乳腺中唯一具有泌乳能力的细胞，MECs的增殖活性和数量决定了乳腺的发育程度和泌乳性能。因此，研究影响MECs增殖活性的因素及调控机制是阐明乳腺发育机制的有效途径。MECs的增殖活性主要受到激素的调控，但随着研究的不断深入，其他营养素也被证实能够影响MECs的增殖活性，在缺少脂肪酸和氨基酸等营养物质的情况下，MECs的增殖活性较低[9]，烟酸、月桂酸和油酸等均被证实可以通过提高mMECs的增殖活性从而促进乳腺发育[9-11]。

氨基酸是机体不可或缺的营养素，已有研究表明，精氨酸、丝氨酸等均对细胞增殖具有影响[12-13]。蛋氨酸(Met)作为机体的必需氨基酸，目前已被证实对mMECs的泌乳性能具有促进作用[14]，但是其对小鼠乳腺发育的影响尚不清楚。因此，本研究通过在青春期小鼠饮用水中添加蛋氨酸以及使用蛋氨酸处理mMECs的方法，分别在体内和体外探索蛋氨酸对青春期小鼠乳腺发育的影响及调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞的复苏培养与处理将冻存的mMECs复苏后转移至含有10% FBS的DMEM中培养，随后传代于60 mm培养皿中。待细胞融合至50%～60%时，用不同浓度的蛋氨酸(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L)处理细胞48 h，期间每隔24 h更换新鲜培养基，重新添加蛋氨酸处理。

1.2 CCK-8细胞增殖活性检测将mMECs传代于96孔板中，添加蛋氨酸处理48 h后，使用CCK-8细胞增殖活性检测试剂盒，按照操作说明检测细胞增殖活性。

1.3 Western blot用蛋氨酸处理mMECs 48 h后，提取细胞总蛋白。测定蛋白质量浓度后，用NP40及5×SDS分别将不同的蛋白质样品配制成相同质量浓度，并高温变性。通过SDS-PAGE分离目标蛋白质并转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，于4℃与相应的一抗孵育过夜后，用相对应的二抗进行孵育，每次抗体孵育完成后使用TBST洗涤PVDF膜，最后用ECL超敏发光液于暗室中显影。

1.4 全组织染色脱颈处死小鼠后，剥离第4对乳腺组织。将乳腺组织充分展开于载玻片上，用卡诺氏固定液固定过夜。依次在70%，35%，15%的乙醇中浸泡10 min。用胭脂红染色液 (2 g/L) 染色。随后依次在95%，100%，100%乙醇中浸泡10 min，置于二甲苯溶液中浸泡2 h。封片后在显微镜下观察乳腺发育情况。

1.5 在体试验研究中所涉及的动物试验均按照吉林大学动物保护福利规程进行。将出生后4周的青春期雌性小鼠分为对照组和试验组(饮用水中分别含有0.025%，0.05%，0.1%的蛋氨酸)，每组4只。对照组饲喂正常水，试验组小鼠采取蛋氨酸间隔饲喂法，即每隔2 d更换含蛋氨酸饮用水为正常水，持续4周。

1.6 数据分析数据均显示为平均值±标准差。使用ImageJ 软件(Rawak Software，Inc.德国) 分析蛋白水平变化。使用Graphpad Prism 8.0.1中单方差分析(ANOVA)对数据进行分析。P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 蛋氨酸对青春期小鼠乳腺导管分支的影响本研究结果显示，分别饲喂0.025%，0.05%，0.1%蛋氨酸后，青春期小鼠的乳腺导管分支呈现不同程度的增多(图1)。

A.空白对照组小鼠的乳腺导管分支程度；B.饲喂含有0.025%蛋氨酸饮用水试验组小鼠的乳腺导管分支程度；C.饲喂含有0.05%蛋氨酸饮用水试验组小鼠的乳腺导管分支程度；D.饲喂含有0.1%蛋氨酸饮用水试验组小鼠的乳腺导管分支程度图1 蛋氨酸对青春期小鼠乳腺导管分支的影响

2.2 蛋氨酸对mMECs增殖活性的影响用蛋氨酸处理mMECs后，对mMECs的增殖活性进行了检测。结果显示，蛋氨酸呈浓度依赖的方式显著增强mMECs的增殖活性(图2)。

*示P<0.05,**示P<0.01，****示P<0.001，与NT组比较具有显著性差异图2 蛋氨酸对mMECs细胞增殖活性的影响

2.3 蛋氨酸对mMECs中增殖标志蛋白的影响Cyclin D1 和 PCNA 的上调是细胞增殖的表征。为了阐明蛋氨酸促进mMECs增殖的机制，检测了蛋氨酸处理后mMECs中Cyclin D1和PCNA的变化。结果显示，添加0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L的蛋氨酸可呈浓度依赖方式显著促进mMECs中Cyclin D1和PCNA的表达(图3A,B,C)。

A.Western blot 检测不同浓度蛋氨酸处理mMECs后Cyclin D1和PCNA的蛋白水平变化;B.Cyclin D1;C.PCNA。***示P<0.005及****示P<0.001，与NT组比较差异显著图3 蛋氨酸对mMECs中 Cyclin D1和PCNA蛋白水平的影响

2.4 蛋氨酸对mTOR-4EBP1信号通路活性的影响为了深入探究蛋氨酸促进mMECs增殖活性的机制，检测了蛋氨酸对mTOR信号通路的影响。结果显示，蛋氨酸显著提高了mTOR和4EBP1的活化水平(图4A,B,C)。

A.Western blot 检测使用不同浓度蛋氨酸处理mMECs后mTOR和4EBP1信号分子的活性变化； B.p-mTOR/mTOR;C.p-4EBP1/4EBP1。**示P<0.01,***示P<0.005及****示P<0.001，与NT组比较差异显著图4 蛋氨酸对mMECs中mTOR和4EBP1信号分子活性的影响

2.5 蛋氨酸通过mTOR-4EBP1信号轴对增殖标志蛋白的影响为了探索蛋氨酸是否可以通过mTOR-4EBP1信号轴影响增殖标志蛋白的水平，调控mMECs的增殖活性，在添加蛋氨酸处理mMECs前，先使用雷帕霉素(rapamycin,Rapa，mTOR的特异性抑制剂)预处理mMECs抑制mTOR信号通路的活性。随后检测Cyclin D1、PCNA 和 p-Rb的蛋白水平。结果显示，用Rapa预处理后，mMECs中Cyclin D1、PCNA和p-Rb的蛋白水平显著降低，蛋氨酸对mTOR-4EBP1信号轴的激活作用被显著抑制(图5A,B,C)，并阻断了蛋氨酸对Cyclin D1、PCNA和p-Rb的蛋白水平的上调作用(图5A,D,E,F)。

A.Western blot检测添加Rapa后，mMECs中mTOR、4EBP1和Rb信号分子的活性变化及Cyclin D1和PCNA的蛋白水平变化;B.p-mTOR/mTOR;C.p-4EBP1/4EBP1;D.Cyclin D1;E.PCNA;F.p-Rb/Rb。**示P<0.01,***示P<0.005,****/####示P<0.001；*示与NT组比较差异显著，#示与Met组比较差异显著图5 蛋氨酸激活mTOR-4EBP1信号轴对mMECs中增殖标志蛋白的影响

2.6 蛋氨酸对青春期小鼠乳腺组织中mTOR信号通路及增殖标志蛋白的影响本研究进一步检测了饲喂蛋氨酸后青春期小鼠乳腺组织中mTOR信号通路活性及Cyclin D1和PCNA的蛋白水平变化，结果发现，饲喂含有0.05%和0.1%蛋氨酸的饮用水显著提高了小鼠乳腺组织中Cyclin D1和PCNA的蛋白水平(图6A,B,C)。并且，添加0.025%、0.05%和0.1%蛋氨酸显著提高了乳腺组织中mTOR信号的活性(图6D)。

A.Western blot 检测青春期小鼠乳腺组织中Cyclin D1、PCNA及mTOR信号分子的活性变化；B.Cyclin D1;C.PCNA;D.p-mTOR/mTOR;*示P<0.05,****示P<0.001，与NT组比较差异显著图6 蛋氨酸(Met)对小鼠乳腺组织中mTOR信号分子活性及Cyclin D1和PCNA蛋白水平的影响

3 讨论

乳腺是哺乳动物为新生子代提供营养和先天免疫的唯一器官，乳腺的发育状况直接影响新生幼畜的存活，而青春期乳腺发育的程度决定了泌乳期乳腺泌乳的能效，因此研究青春期乳腺发育的内在调控机制，寻找有效刺激乳腺发育的营养物质具有重要意义。乳腺的发育受到多种因素的影响，日粮中的营养水平对青春期母畜的乳腺发育具有较大的影响[15]。氨基酸作为蛋白质合成的底物，也参与调控机体的生长发育。目前蛋氨酸已经被证实能够促进MECs乳合成[16-17]，但是能否促进乳腺发育尚不清楚。在本研究中，通过饲喂含有蛋氨酸的饮用水，发现蛋氨酸可以促进乳腺导管形成分支；使用不同浓度的蛋氨酸处理mMECs，发现蛋氨酸可以通过增强mTOR-4EBP1信号通路活性提高Cyclin D1和PCNA蛋白水平以及Rb的磷酸化水平，显著增强mMECs的增殖活性。

Cyclin D1是推动细胞增殖周期进程的关键蛋白，在G1期和G2期高表达[18]；PCNA是DNA聚合酶的辅助蛋白，在DNA复制和细胞分裂中具有重要作用[19]。PCNA已被证实可以与周期蛋白依赖性激酶 (cyclin-dependent kinases,CDKs) 或Cyclin 形成复合物参与细胞增殖[20-21]。因此，Cyclin D1和PCNA的表达水平是检测细胞增殖的重要指标。研究发现Cyclin D1可以与CDK4/6和Rb蛋白形成复合物，推动细胞周期进程[22-23]。也有研究发现Rb蛋白的磷酸化水平升高后，可释放E2F转录因子，促进细胞分裂[24-26]。在本研究中，蛋氨酸以浓度依赖的方式显著提高mMECs中Cyclin D1和PCNA的蛋白水平以及Rb蛋白的磷酸化水平。而且，在体试验结果显示，蛋氨酸也显著增加乳腺组织中Cyclin D1和PCNA的蛋白水平。这些结果均表明蛋氨酸可以通过提高mMECs中Cyclin D1和PCNA的蛋白水平，促进mMECs增殖。

以往的研究表明，mTOR信号通路在调控细胞增殖过程中发挥重要作用[27-28]。本研究发现蛋氨酸显著提高了mMECs及乳腺组织中mTOR信号分子的活化水平。因此，为了探究蛋氨酸是否能通过激活mTOR信号影响增殖相关蛋白的水平，本研究使用雷帕霉素抑制mTOR信号通路的活性，进一步探索mTOR在蛋氨酸调节乳腺发育中的作用。结果表明，mTOR信号通路被抑制后，阻断了蛋氨酸对mMECs中Cyclin D1和PCNA蛋白水平的上调作用。而且蛋氨酸对Rb的激活作用也被显著抑制。以上结果均表明，蛋氨酸可通过mTOR-4EBP1调控Cyclin D1和PCNA的表达以及Rb的磷酸化水平，继而影响mMECs的增殖活性。

综上研究结果表明，蛋氨酸通过激活mTOR-4EBP1信号轴提高Cyclin D1和PCNA的表达水平及Rb的磷酸化水平，增强mMECs的增殖活性，促进乳腺导管分支，最终促进青春期乳腺发育。