海洋细菌Pseudoalteromonas sp. HL9的筛选鉴定及产磷脂酶B性质

王 藏，马小艺，田小鹏，祖航天，丁延帅，吕明生，王淑军,*

（1.江苏海洋大学 海洋资源与环境重点实验室，海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005；2.江苏海洋大学 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005）

磷脂酶是能特异性水解磷脂的酶的统称，分布于动物、植物和微生物中。广泛应用于医药、油脂精炼、磷脂改性、食品加工等领域[1-5]。另外，磷脂酶在许多生理过程中起重要作用，如信号转导、磷脂代谢、细胞骨架组织等[6-7]。磷脂酶根据作用于底物的位置不同可以分为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D[8-14]。

磷脂酶B（又称溶血磷脂酶，EC.3.1.1.5）能够水解sn-1和sn-2的酰基，释放出溶血磷脂和两个脂肪酸；同时，还具有溶血磷脂酶和转酰基酶活力[15]。研究发现，磷脂酶B在人体和动物的表皮细胞[9,16]、细菌[17-19]和真菌[20-21]中大量存在。已有磷脂酶B基因克隆表达的相关研究[22-23]。磷脂酶B在油脂精炼的脱胶上起关键性作用，可以把非水合磷脂转化为相应的水合形式，通过离心进行分离和去除[22]。与传统脱胶方法相比，减少了化学药品的消耗，降低损耗[15]。在高附加值磷脂衍生物的生产方面亦起着重要作用[1]。甘油磷脂酰胆碱作为体内天然存在的较少的水溶性磷脂代谢产物，可延缓记忆力衰退，治疗脑部中风与脑部损伤患者，故常用于食品保健中，而使用磷脂酶水解磷脂制备甘油磷脂酰胆碱，得率高于其他方法[24]。李蔚筠等[25]探索华支睾吸虫分泌排泄蛋白磷脂酶B（Clonorchis sinensisphospholipase B，CsPLB）与乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus，HBx）共同作用对HepG2肝癌细胞株增殖、凋亡的影响，研究发现rCsPLB与HBx共同作用可促进HepG2细胞的增殖和凋亡。此外，磷脂酶B还可以加快受损皮肤的修复，引起了化妆品行业的注意[15]。磷脂酶B在食品添加剂、医药和化妆品等领域的市场需求大[24,26]。

海洋的微生物种类繁多，因特殊的地理环境，微生物的特性与陆生微生物有较大差异，是筛选新型产酶菌株以及获得独特磷脂酶B的重要来源[27-28]。本研究从黄海49 m深处采集泥样，筛选产磷脂酶B活性高的微生物菌株，进行菌株鉴定、生长特性、发酵条件以及酶学性质研究，拟为该菌株及其酶的进一步应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

取自黄海49 m深处采集的底泥样品。

1.1.2 培养基

富集培养基：蛋黄卵磷脂1 g/L、陈海水、pH值自然；分离培养基：蛋黄卵磷脂2 g/L、琼脂20 g/L、陈海水、pH值自然；发酵培养基：酵母粉10 g/L、葡萄糖10 g/L、陈海水、pH值自然；种子液培养基：葡萄糖10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、陈海水、pH值自然；硼砂卵黄固体平板：硼酸10.9 g/L、硼砂1.9 g/L、琼脂粉20 g/L、蛋黄20 g/L、pH 7.2～7.4。

1.1.3 试剂

磷脂酰胆碱标准物质、磷脂酸标准物质、溶血磷脂酰胆碱标准物质、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 美国Aladdin公司；软脂酸标准物质、油酸标准物质国家标准物质中心；蛋黄卵磷脂 生工生物工程（上海）股份有限公司；GF254硅胶薄层板 青岛海洋化工厂分厂；蛋白胨、琼脂粉等均为生化试剂。

1.2 仪器与设备

SPX-150B-Z型生化培养箱 上海博迅公司；Innova 44R恒温摇床、Centrifuge 5424R型离心机 德国Eppendorf公司；Multiskan GO全波长酶标仪 美国Thermo Scientific公司；7890A型气相色谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 产酶菌株富集与分离纯化

取1 g海泥接入50 mL富集培养基中，180 r/min、30 ℃摇瓶富集培养24 h，将富集培养液梯度稀释10-1～10-7后涂布到分离培养基上，挑选带有透明圈的菌落，进一步纯化后保藏。

1.3.2 产酶菌株形态特征及鉴定

菌株平板划线培养后，观察菌落形态，进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色、鞭毛染色、生物扫描电镜观察。对菌株进行生理生化实验。将菌株培养12 h，提取DNA（杭州宝赛DNA试剂盒），使用细菌16S rDNA通用引物进行基因扩增，通用引物为：上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。系统发育树的构建：通过软件DNAMNA和MEGA对序列进行分析，用Neighbor-joining构建系统发育树，并进行系统发育分析。

1.3.3 产酶菌株生长条件优化

在种子培养基的基础上，研究不同碳源、氮源、温度、pH值、NaCl对菌株生长的影响。碳源质量浓度为10 g/L（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、马铃薯淀粉、玉米粉、大麦粉、米糠、麸皮、糊精）；氮源的质量浓度为10 g/L（胰蛋白胨、鱼粉蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、花生粉、羽毛粉、干酪素、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠）；温度分别设置为20～45 ℃；配制pH值分别为5～11的培养基；NaCl质量浓度设置为0～100 g/L。培养条件为180 r/min、25 ℃培养24 h，检测菌液OD600nm。

1.3.4 粗酶液的制备

将产酶菌株接种到种子培养基中，180 r/min培养，装液量20%，25 ℃培养9 h，将种子液以2%的接种量接种至发酵培养基中，180 r/min、30 ℃培养48 h后，将发酵液7 104×g离心20 min，取上清液，4 ℃保藏备用。

1.3.5 磷脂酶活力测定

根据代书玲等[29]的方法，采用硼砂卵黄平板牛津杯法测定酶活力。将用缓冲液稀释5 倍的粗酶液加入放置在硼砂卵黄平板上的牛津杯中，37 ℃温育24 h，测定晕圈的直径判断酶活力。根据吉得宁[30]的方法，加以改进，测定粗酶液中的磷脂酶活力与脂肪酶活力。

1.3.6 菌株产酶发酵条件优化

在发酵培养基上，研究不同的碳源、氮源、温度、pH值、NaCl、接种量、发酵时间对菌株发酵产酶的影响。质量浓度为10 g/L的碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、马铃薯淀粉、蛋黄卵磷脂、米糠、麸皮、糊精）替换发酵培养基中的葡萄糖制备培养基；用质量浓度为10 g/L氮源（胰蛋白胨、鱼粉蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、羽毛粉、花生粉、干酪素、尿素、硫酸铵）替换发酵培养基中的酵母粉配制培养基，并配制不同质量浓度最佳碳氮源（5～40 g/L）进行优化；配制pH值分别为6～9.5的发酵培养基；温度分别设置为15～45 ℃；NaCl质量浓度设置为10～100 g/L；接种量设置为0.5%～4%。发酵时间设为从12 h起每隔6 h取样1 次。在30 ℃摇床培养48 h后，7 104×g离心20 min，测定上清液中粗酶液活力。

1.3.7 菌株产酶发酵条件正交试验

在单因素试验的基础上，选取对产酶影响较大的因素（麸皮、鱼粉蛋白胨、温度、pH值），采用4因素3水平设计正交试验优化产酶条件。试验因素与水平设计见表1。

表1 培养基配方优化正交试验因素与水平Table 1 Independent variables and levels used in orthogonal array design for medium formulation optimization

1.3.8 水解产物薄层层析（thin layer chromatography，TLC）和气相色谱分析

将0.25 mL 5 mg/mL卵磷脂溶液加入1 mL粗酶液，30 ℃恒温摇床200 r/min，孵育12 h，加入0.5 mL 50 mmol/L乙二胺四乙酸溶液和5 mL三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）混合液，剧烈振荡后静置分层，取出有机相真空蒸发得到的白色残留物，加0.2 mL三氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）混合液溶解后，进行薄层层析。展开剂为氯仿-甲醇-乙酸（40∶15∶6，V/V）用碘熏蒸显色[31]。

采用0.25 mL 5 mg/mL 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱溶液与1 mL粗酶液，30 ℃恒温摇床200 r/min，孵育12 h。将水解产物与软脂酸、油酸标准物质分别进行脂肪酸甲酯化。步骤如下：取水解产物1 mL，软脂酸、油酸各2 mg分别放置于具塞试管中，加入1 mL 1%氢氧化钠-甲醇溶液，振荡混匀，充1 min氮气。75 ℃水浴皂化15 min，冷却至室温。加入2 mL 5%盐酸-甲醇溶液，振荡混匀，充1 min氮气。75 ℃水浴15 min进行甲酯化，冷却至室温。加入2 mL正己烷萃取。将待测液装入进样瓶，气相色谱检测。色谱条件：DB-1毛细管色谱柱（30 m×0.530 mm，3 μm），载气为N2，进样量1 μL，流速2.5 mL/min，分流比15∶1，进样口温度250 ℃，柱温从170 ℃以5 ℃/min上升至250 ℃，保持28 min，检测器温度250 ℃。

1.3.9 磷脂酶性质分析

根据硼砂卵黄平板牛津杯法，测定磷脂酶的最适作用温度、最适作用pH值、金属离子对酶活力影响、有机溶剂对酶活力影响。设置温度为30～60 ℃；用乙酸钠缓冲液、磷酸钠缓冲液和Tris-盐酸缓冲液将硼砂卵黄固体平板的pH值调至4～9。将Ca2+、Ni2+、Co2+、Mg2+、Mn2+、Si2+、Zn2+、Ba2+、Fe3+、K+、Cu2+等离子盐按1 mmol/L浓度添加到硼砂卵黄固体平板中；将有机溶剂与酶液、缓冲液按1∶2∶7的比例混合。取100 μL的待测液置于等距放置在硼砂卵黄平板上的牛津杯中，45 ℃温育，检测酶活力。

1.4 统计分析

实验采用3个平行样，对结果计算平均值，并进行标准差分析。差异显著性分析采自SPSS中的S-N-K（S）。

2 结果与分析

2.1 磷脂酶产生菌的筛选与鉴定

经多轮筛选，共获得11 株菌，选择透明圈最大的菌株HL9，如图1A所示，菌株呈圆形，表面光滑，边缘整齐，呈乳白色，菌落周围出现较大的透明晕圈。革兰氏阴性菌，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，扫描电镜显示该菌为短杆菌（图1B）。16S rDNA的序列全长为1 401 bp，用Neighbor-joining构建系统发育树，系统发育树如图2所示，菌株HL9与假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）相似度达到99%。如表2所示，该菌株不能利用大部分糖醇，精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、氧化酶、苯丙氨酸呈阳性。

表2 菌株HL9的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain HL9

图1 菌株HL9菌落形态Fig. 1 Colony morphology of strain HL9

图2 菌株HL9系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of strain HL9

2.2 菌株HL9生长条件优化

2.2.1 不同碳源、氮源对生长的影响

如图3所示，菌株适应多种碳源，最终选择米糠作为最适碳源；菌株在有机氮源条件下生长较好，在无机氮源中生长较差，最终选择酵母粉作为最适氮源。

图3 碳源（A）和氮源（B）对菌株生长的影响Fig. 3 Effects of carbon source (A) and nitrogen source (B) on the growth of strain HL9

2.2.2 温度、pH值及NaCl质量浓度对生长的影响

如图4A所示，菌株在20～35 ℃范围内生长稳定，25 ℃时生长最好，45 ℃几乎不生长。如图4B所示，菌株在pH 6～9范围内生长良好，在pH 5.5和pH 10条件下，菌株无法生长。如图4C所示，在无NaCl条件下菌株不能生长，在NaCl质量浓度为30 g/L时，菌株生长最好。该菌在较高盐度（100 g/L）条件下，依然生长良好，值得关注。窦旖君等[32]筛选的假交替单胞菌属亦在较高质量浓度下生长良好。

图4 温度（A）、pH值（B）及NaCl质量浓度（C）对菌株生长的影响Fig. 4 Effects of temperature (A), pH (B) and NaCl concentration (C)on the growth of strain HL9

2.3 菌株HL9产酶条件优化

2.3.1 碳源及添加量对产酶的影响

如图5所示，麸皮和葡萄糖促进产酶的能力较强，选用麸皮为产酶碳源，10 g/L麸皮产酶效果最好。

图5 碳源种类（A）和碳源添加量（B）对菌株产酶的影响Fig. 5 Effects of carbon source type (A) and concentration (B) on enzyme-producing capacity of strain HL9

2.3.2 氮源及添加量对产酶的影响

如图6A所示，鱼粉蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉和羽毛粉等产酶效果良好，最终选用鱼粉蛋白胨为发酵培养基氮源。如图6B所示，5 g/L鱼粉蛋白胨产酶效果最好。随着添加量的增加，产酶效果逐渐减弱。

图6 氮源种类（A）和氮源添加量（B）对菌株产酶的影响Fig. 6 Effects of nitrogen source type (A) and concentration (B) on enzyme-producing capacity of strain HL9

2.3.3 温度、pH值及NaCl质量浓度对产酶的影响

如图7A所示，15～25 ℃产酶效果一直呈上升趋势，在25 ℃时达到最高，随后开始降低，在40 ℃时不产酶，故选用25 ℃为发酵产酶温度。如图7B所示，菌株在pH 7～9范围内产酶能力稳定，在pH 8时产酶效果最好，最终选用pH 8配制发酵培养基。图7C结果表明，在NaCl质量浓度为20 g/L时产酶最好，在NaCl质量浓度范围为30～80 g/L时相对酶活力亦可达到95%。质量浓度高于90 g/L时不利于产酶。

图7 温度（A）、pH值（B）及NaCl质量浓度（C）对菌株产酶的影响Fig. 7 Effects of temperature (A), pH (B) and NaCl concentration (C)on enzyme-producing capacity of strain HL9

2.3.4 接种量和发酵时间对产酶的影响

图8结果表明，在接种量为2%时产酶最好；在发酵48 h产酶达到最高，随后逐渐下降。

图8 接种量（A）和发酵时间（B）对菌株产酶的影响Fig. 8 Effects of inoculum amount (A) and fermentation time (B) on enzyme-producing capacity of strain HL9

2.4 培养基配方优化正交试验结果

表4 正交试验方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal array design results

正交试验结果与方差分析见表3、4。4个因素对产酶影响不显著（P＞0.05），发酵培养基最优组合为A2B1C3D3，即培养基中加入10 g/L麸皮、5 g/L鱼粉蛋白胨，pH 8.5，培养温度30 ℃。4因素的影响均为不显著，表明该菌在发酵产酶中适应性较好。

表3 培养基配方优化正交试验设计与结果Table 3 Orthogonal array design with experimental results for optimization of medium formulation

2.5 水解产物分析

为了判断该磷脂酶的水解产物，选用TLC检测。由图9可见，水解产物中有溶血磷脂酰胆碱，也有脂肪酸，尚难以判断水解的是sn-1酰基还是sn-2酰基。为了进一步判断该磷脂酶为A1、A2或B型。运用气相色谱进行定性分析，水解产物中分别含有软脂酸和油酸。结果表明，该磷脂酶可以同时水解sn-1酰基和sn-2酰基，筛选的磷脂酶为磷脂酶B。在水解产物中，油酸占70.67%，软脂酸占29.33%。表明该磷脂酶B以水解sn-2酰基为主。经滴定法检测，该磷脂酶B的发酵液酶活力为1.2 U/mL，发酵液没有检测到脂肪酶活力。

图9 水解产物分析Fig. 9 TLC analysis of hydrolysates

2.6 菌株HL9磷脂酶B的性质

2.6.1 温度、pH值对酶活力的影响

如图10A所示，温度对酶的活力影响较大，在30～50 ℃时酶活力可以保持80%以上，45 ℃是该酶最适作用温度。如图10B所示，在pH 4～7.5范围内随着pH值的升高酶活力也随之增加，在pH 7.5时达到最高，随后酶活力开始下降。在pH 7～8之间时，酶活力较稳定。Jiang Fangyan等[33]研究发现重组荧光假单胞菌磷脂酶B的最适作用温度仅为30 ℃，最适作用pH值为6。本研究筛选的磷脂酶B具有较高的作用温度，并适用于碱性条件。

图10 温度（A）和pH值（B）对酶活力的影响Fig. 10 Effects of temperature (A) and pH (B) on the activity of phospholipase B

2.6.2 金属离子对酶的作用

如表5所示，Ca2+、Co2+、Mn2+、Si2+、Zn2+、Ba2+对酶活力有促进作用，Ni2+、Mg2+、Fe3+、K+对酶活力影响较小，而Cu2+对酶活力有较大的抑制作用。

表5 金属离子对酶稳定性的影响Table 5 Effects of metal ions on the stability of phospholipase B

2.6.3 有机溶剂对酶的作用

如表6所示，该酶对有机溶剂耐受性好，酶活力均能保持在80%以上。有利于该酶水解溶于有机相中的脂质。

表6 有机溶剂对酶稳定性的影响Table 6 Effects of organic solvents on the stability of phospholipase B

3 结 论

本研究从黄海海泥中筛选出1 株产磷脂酶B的假交替单胞菌属菌株HL9。对该菌株的生长特性和产酶特性进行了研究。水解产物的气相色谱与TLC结果表明，菌株HL9产的是磷脂酶B，并以水解sn-2酰基为主，产物中油酸占70%。磷脂酶B活力为1.2 U/mL，无脂肪酶活力。酶的最适作用温度和pH值分别为45 ℃和7.5。有机溶剂对酶活力影响较小。研究结果表明该酶具有独特的酶学性质，为进一步研究酶的结构与功能打下了基础。该酶在食品和医药等领域中具有较好的应用潜力。