借助自组装多肽水凝胶构建高活性复层结膜上皮细胞片*

王 华， 唐浚杰▲， 徐李玲， 陈芳圆， 王颖薇， 周 清△， 陈 剑△

（暨南大学1第一临床医学院，2生命科学技术学院，3基础医学院，广东 广州 510630）

眼表化学伤是一种常见的眼部急症，可导致严重视力损害，占眼部急症的0.1%～15%，估计发病率为每年每10 万人0.051～50 例［1］。眼表化学伤的治疗主要是眼表重建，包括角膜、结膜、泪膜和眼睑的重建。结膜上皮由层状鳞状上皮和分泌黏蛋白的杯状细胞组成，可调节眼表微环境，维持泪膜稳定，保持角膜表面光滑。因此，成功的结膜重建是恢复眼表结构完整和功能稳定的重要前提。然而，眼表化学伤患者通常缺乏足够的健康结膜组织进行结膜重建，而异种结膜组织又存在免疫排斥反应［2］。

为了解决免疫排斥和移植材料短缺的问题，为结膜重建提供理想的替代品，已有研究开发了组织工程结膜细胞片。目前结膜细胞片的构建主要是通过直接在支架表面种植细胞获得结膜移植物［3］。直接种植存在以下缺点［4-5］：（1）上皮难以快速分层；（2）细胞容易从支架上脱落；（3）杯状细胞分化差。直接种植只构造了一个单层细胞面，虽然细胞可以逐步分化形成多层细胞面，但随着培养时间的延长，底层细胞的逐渐出现衰老和凋亡，细胞和支架之间的黏附力也开始降低。

RADA-16是一种广泛应用的自组装纳米多肽水凝胶，在生理条件下可以自组装成孔隙尺寸为50～200 nm、含水量大于99% 的网络结构［6］，可以模拟细胞外基质的三维结构，提供一个利于细胞生长的三维环境，促进细胞的增殖和迁移［7］，已被成功应用于软骨细胞、间充质干细胞、内皮细胞等不同类型的细胞培养［8-10］。该材料还用于组织工程，促进骨组织和神经组织的再生，显示其具有支持细胞附着、增殖和分化的能力［11-12］。

基于此，我们设想将RAD16-I 与兔结膜上皮细胞（rabbit conjunctival epithelial cells，rCECs）混合后种于脱细胞的细胞外基质（decellularized extracellu‑lar matrix，dcECM）上，希望其也能发挥相关的调控作用，进一步促进结膜上皮细胞的增殖，从而快速形成复层细胞片。本研究以此为切入点，评价RAD16-I对结膜上皮细胞复层过程的影响，探讨其作用机制及应用潜能。

材料和方法

1 动物

新西兰大白兔，雌雄不限，2.5～3.0 kg，普通清洁级别，用于结膜上皮细胞及结膜组织取材，来源于暨南大学医学院动物房及广州花都区花东信华实验动物养殖场［许可证号为SCXK（粤）2019-0023］。

2 主要试剂

高糖DMEM 培养液、PuraMatrix™（RAD16-I）及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Corning；分散酶（dispase）Ⅱ、0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA、细胞角蛋白（cytokeratin，CK）4、CK13、黏蛋白5AC（mu‑cin 5AC，MUC5AC）、磷脂酶A2 及脱氧胆酸钠购自Sigma；pan-cadherin 抗体、laminin 抗体、Alexa Fluor 488 及Alexa Fluor 594 购自Abcam；collagen I 和colla‑gen IV 抗体购自Affinity；核酸染料DAPI 购自Invitro‑gen；磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）及碳酸盐缓冲液（carbonate-buffered saline，CBS）购自Biosharp；阿尔辛蓝（Alcian blue，AB）-过碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色试剂盒及Calcein-AM/PI 活/死细胞双染试剂盒购自北京索莱宝公司；樱花OCT包埋剂购自上海鑫乐公司。

3 主要方法

3.1 细胞培养采用酶消化法［13］，新西兰大白兔耳缘静脉注入空气处死，立即取结膜组织，充分分离干净多余的脂肪和肌肉组织。用含有1% 青霉素/链霉素 的PBS 冲 洗3 次，后 用2.0×103U/L disase Ⅱ在37 ℃、5% CO2中浸泡2 h；再用0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 消化5 min，加入完全培养液终止消化，离心收集细胞，以1×108/L 接种培养，待细胞生长增殖到80% 汇合时及时传代。每天倒置显微镜下观察细胞形态变化及其生长增殖情况。

3.2 rCECs 的鉴定当传代细胞达到80% 汇合时，用75%乙醇固定，用AB-PAS染色试剂盒检测结膜杯状细胞。AB 染色20 min 后氧化剂氧化5 min，Schiff试剂染20 min，苏木素染色1 min 后酸性分化液分化2 s，最后用Scott 蓝化液返蓝。细胞表型通过免疫荧光染色确定，用PBS 冲洗细胞数次，然后在室温下用1% Triton X-100 孵化30 min，10% 山羊血清孵化1 h，然后用Ⅰ抗在4 ℃孵育过夜，对照组加PBS。随后，室温下Ⅱ抗避光孵育2 h。

3.3 dcECM 的制备新鲜兔结膜组织用CBS 浸泡12 h，然后放入含有2×106U/L磷脂酶A2和5 g/L脱氧胆酸钠的CBS 中室温下水浴震荡6 h，CBS 洗涤3 次后放入含2×106U/L 磷脂酶A2 的CBS 中室温下水浴震荡12 h。最后将结膜组织用生理盐水清洗50 h（每2 h更换一次生理盐水）。所得样品干燥至恒重，角膜环钻裁剪成直径12 mm 的圆形，钴60（25 kGy）灭菌后4 ℃保存备用。

3.4 dcECM 脱细胞效率检测采用HE染色和免疫荧光染色观察dcECM 脱细胞前后的变化。简而言之，dcECM 和天然结膜（natural conjunctiva，NC）的样品被冷冻在OCT 化合物中，制备成5 μm 切片，行HE染色和collagen I免疫荧光染色以观察异种细胞去除效果及天然细胞外基质存留情况。DNA 提取试剂盒提取DNA 后使用超微量紫外分光光度计测定所提取DNA 样品的浓度，根据溶液体积计算得到各样品DNA含量，以评估脱细胞效率。

3.5 dcECM 的复水能力及体外降解能力为比较NC 和dcECM 的复水能力，将恒重干燥的NC 和dcECM（n=5）样品的质量记为m0。样品在PBS 中浸泡24 h 后，再次称量质量，记为m1。样品的含水率（%）=（m1−m0）/m1×100%。

为比较NC和dcECM的降解能力，将恒重干燥的NC 和dcECM（n=3）切成1 cm×1 cm 的样品，测量其确切质量，记为m0，37 ℃下将其置于PBS 中，浓度为1.5 g/L。分别于第1、4、7、14、21、30、45、60 和90 天将样品取出，用蒸馏水清洗后干燥，测量其质量，记为m1。样品的体外降解率（%）=（m0−m1）/m0×100%。

3.6 细胞片的构建首先将灭菌后的dcECM 固定在环架上，室温下用培养基复水30 min。随后，酶消化法收集足量细胞（每个细胞片用5×105rCECs）用于组织工程结膜（tissue engineering conjunctiva，TEC）上皮细胞片的构建。rCECs 经10% 蔗糖溶液洗涤后离心，用80 μL 蔗糖溶液和20 μL RAD16-I 多肽水凝胶重悬，随后，将细胞混悬液加入到复水后的dcECM表面。对照组不使用RAD16-I，即消化收集5×105rCECs，使用100 μL 完全培养液重悬后直接种植到复水后的dcECM 的表面。构建完成后加入2 mL 培养基置于37 ℃、5% CO2培养箱。

3.7 细胞活/死染色检测细胞活性每天用倒置显微镜观察细胞形态。培养5 d后，从细胞培养箱中取出样品进行评估。用Calcein-AM/PI 活/死细胞染色试剂盒来检测细胞存活率。简而言之，在荧光显微镜下观察（随机选择5 个视野，20 倍放大）活细胞（绿染）和死细胞（红染），使用ImageJ 软件计数。活细胞比例用活细胞数除以总细胞数来计算。

3.8 组织学及免疫荧光分析为比较细胞片的结构、细胞表型和基质成分，将细胞片包埋于OCT后制成20 μm 切片。行HE 染色观察组织结构；ImageJ 软件测量上皮层平均厚度；行CK4、CK13 及MUC5AC免疫荧光检测观察细胞表型及基质成分；行collagen IV、pan-cadherin 及laminin 免疫荧光染色检测细胞间及细胞与基质间的连接情况。

4 统计学处理

所有统计分析均使用GraphPad Prism 6.0 软件进行。数据均用均数±标准差（mean±SD）表示。采用独立样本t检验进行统计分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 rCECs的体外培养与鉴定

大多数rCECs 在接种24 h 内贴壁生长。随着培养时间的延长，rCECs 呈半透明圆形（图1A）。ABPAS 染色显示结膜上皮原代培养中存在杯状细胞（图1B）。免疫荧光染色显示，培养细胞中结膜上皮细胞标志物CK4 和杯状细胞特异性黏蛋白MUC5AC阳性表达（图1C、D），与结膜上皮细胞表型一致。

2 脱细胞基质的外观

NC 呈乳白色薄膜，脱细胞后，dcECM 呈半透明的白色薄膜，透明度较NC增加（图2A）。

3 脱细胞基质的结构

HE 和免疫荧光染色（图2B、C）证实异种细胞成分基本完全去除，天然胶原纤维结构得到完整保留。NC 的DNA 含量为（1 846.85±66.15）μg/g，脱细胞后DNA 含量显著下降至（46.47±2.48）μg/g，表明细胞成分有效去除（图2D）。

4 脱细胞基质的性质

dcECM 的水分含量与NC 相比无显著差异（82.20%vs80.20%，P>0.05），见图2E。两者的体外降解率亦无显著差异（P>0.05），见图2F。这些结果表明，磷脂酶A2 可以有效地去除异种抗原成分，同时完整保留天然细胞外基质的胶原结构，达到脱细胞的效果；此外，理化性质并不会因脱细胞过程而改变。

5 RAD16-I构建细胞片的流程及结果

rCECs 与RAD16-I 混合后种植在dcECM 表面构建三维细胞片（图3），不添加RAD16-I直接将细胞混悬液种植在支架上作为对照组。

6 RAD16-I对细胞活力的影响

2 种方式构建的细胞片在培养第3 天均混合在一起，呈鹅卵石状（图4A）。细胞活/死染色（图4B）显示，和二维对照组相比，仅有散在死细胞（红点）隐藏在三维细胞片内，独立样本t检验显示，三维细胞片活细胞比例（97.90%）与二维细胞片（89.31%）相比有显著差异（P<0.01），见图4D。

Figure 1. In vitro expansion of rabbit conjunctival epithelial cells.A：light microscopic images of rabbit conjunctival epithelial cells；B：Alcian blue-periodic acid-Schiff staining to identify goblet cells；C and D：immunofluorescence staining of cultured rab‑bit conjunctival epithelial cells using antibodies against CK4 and MUC5AC.图1 兔结膜上皮细胞的体外扩增

7 RAD16-I对细胞复层能力的影响

HE 染色（图4C）显示，三维细胞片中的rCECs 与基质紧密连接，形成4～5 层上皮，而对照组仅形成1～2层上皮。经统计学分析，上皮平均厚度差异有统计学意义［（20.19±1.05）μmvs（6.12±0.45）μm，P<0.05］，见图4E。

8 RAD16-I对细胞增殖能力的影响

CK4、CK13 和MUC5AC 免疫荧光染色鉴定细胞片的细胞表型。三维细胞片中检测到结膜上皮细胞标志物CK4 和CK13 及杯状细胞特异性黏蛋白MUC5AC，而对照组中未检测到，见图5。

9 RAD16-I对胞间连接能力的影响

免疫荧光染色检测鉴定细胞片的细胞外成分及胞间连接，结果显示，pan-cadherin、laminin 和colla‑gen IV 在2 组均呈阳性表达，但添加RAD16-I 的细胞片的胞间连接明显强于对照组，见图6。

讨 论

在临床上，自体结膜或结膜替代品常用于结膜重建。虽然自体结膜是结膜重建的最佳选择，但它仅限于有足够健康结膜组织的患者。羊膜（amotic membrane，AM）是一种常用的结膜移植替代品，可有效减少结膜表面炎症，防止结膜瘢痕形成。然而，AM 在眼表重建方面仍具有一定的限制性。传统的AM 移植治疗存在疾病传播和异源反应等风险，AM移植物在炎症环境中可能快速降解，这极大地限制了其在严重炎症环境中的应用，如眼表化学烧伤［14-15］。在此基础上，结膜细胞片因其低免疫原性和良好的生物相容性而发展成为理想的结膜替代品。

dcECM 是通过物理和化学过程来去除细胞结构、核酸和抗原成分的［16］。dcECM 具有以下优势［17］：组织特异性的生物力学强度和生物相容性，能有效促进细胞迁移、增殖和分化；该材料来源广泛，生物性能稳定；制备方法简单易操作。结膜基质主要由3种大分子蛋白组成：层粘连蛋白、糖蛋白和胶原蛋白［18］。我们用磷脂酶A2 对兔结膜进行脱细胞处理，结果证实脱细胞处理后的结膜上皮层被完全去除，基质中的胶原纤维结构得到保留。虽然目前对脱细胞支架和种子细胞的研究有所改进，但如何将这两种重要元素结合起来仍然是一个挑战。

RAD16-I 是由麻省理工学院的张曙光教授等人发现的一种知名的自组装多肽水凝胶，它在水介质中形成β-结构并自组装成纳米纤维［19］。 由于RAD16-I 具有良好的生物相容性，可促进细胞增殖和组织再生，因此其商业名称为PuraMatrix［20-21］。近年来，RAD16-I 越来越多地被用作组织再生的人工支架。有报道称，自组装多肽水凝胶的浓度会影响细胞形状，常用的浓度范围为0.2%～0.5%［22］。在本研究中，我们将RAD16-I 的浓度稀释至0.2%，因为rCECs在该浓度下表现出更好的分层能力。

Figure 2.Preparation of decellularized conjunctiva.A：photographs of decellularized extracellular matrix（dcECM）and natural con‑junctiva（NC）after dehydration；B：histological analysis of dcECM and NC；C：immunofluorescence staining of dcECM and NC using antibodies against collagen I（COLI）；D：DNA content of dcECM and NC；E：moisture content of dcECM and NC after rehydration；F：in vitro degradation capacity of dcECM and NC.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs NC group.图2 脱细胞结膜的制备

Figure 3.Overall approach for the construction of multilayer cell sheet.图3 构建复层细胞片的流程及结果

Figure 5.Cell phenotype in tissue engineering conjunctiva（TEC）.Immunofluorescence staining for CK13（A），CK4（B）and MUC5AC（C）expression in the cells on 3D TEC and control TEC.图5 组织工程结膜细胞片的细胞表型

Figure 6.Extracellular components in tissue engineering con‑junctiva （TEC）.Immunofluorescence staining for cadherin（A），laminin（B）and collagen IV（C）ex‑pression in the extracellular matrix of 3D TEC and control TEC.图6 组织工程结膜细胞片的细胞外成分

前期研究发现，气/液界面培养提供了一个更接近体内的培养环境，可以促进细胞增殖、分化及快速复层［23］。一些研究已经实现了在生物支架上的结膜上皮细胞复层。例如，Zorn-Kruppa 等［24］在气/液界面下培养6 d 后实现了3 层以上的结膜上皮细胞复层；Gipson 等［25］将结膜上皮细胞在涂有I 型胶原的Tran‑swell上培养后实现了2～3层的复层；Bosworth等［26］在dcECM-PCL静电纺丝支架上实现了结膜上皮细胞的复层。在本研究中，我们通过RAD16-I 水凝胶将rCECs 和dcECM 有效结合，恢复结膜的固有结构和功能。培养5 d后用HE染色直接观察移植物的整体结构。组织学分析表明，0.2% RAD16-I 构建的细胞片形成了4～5层的细胞复层，而不含RAD16-I的细胞片仅形成1～2 层细胞复层。与通常需要7 d 以上形成复层的传统方法相比，RAD16-I 具有快速形成复层的能力。

细胞分化与周围微环境［27］密切相关。与传统高分子材料的微尺寸相比，RAD16-I 的纳米尺寸更接近于细胞外基质，为细胞提供了一个真实的三维微环境［28］。结膜杯状细胞主要负责分泌黏蛋白形成泪膜。黏液蛋白改变或杯状细胞功能障碍可导致眼表微环境紊乱。因此，杯状细胞的恢复是结膜重建中的一个重要问题。本研究结果表明，对照组在体外培养5 d 后，CK4、CK13 和MUC5AC 均阴性表达，考虑可能是因为结膜上皮细胞在培养过程中因缺乏足够的营养和生长环境发生了衰老和变异，从而引起角蛋白发生变异，该现象此前亦有相关报道［29］。三维培养组结膜杯状细胞在RAD16-I 所创造的微环境中成功分化生长，并在细胞片中检测到杯状细胞特异性标志物MUC5AC。在正常结膜上皮中，杯状细胞通常聚集在一起，几乎插入到整个层状上皮中，与相邻层状上皮细胞形成紧密的连接。结合本研究结果，推测三维微环境和复层结膜上皮可能为杯状细胞的生长提供支持。

细胞-细胞和细胞-基质相互作用决定细胞片的整体结构稳定性。种子细胞与支架之间缺乏足够的生物力学特性，在移植过程中容易出现上皮层脱落，这将极大地影响细胞片的实际临床应用。层粘连蛋白和IV 型胶原是结膜基质的主要成分，在增强细胞与基质的相互作用中起着重要作用［30］。IV型胶原的主要作用是在结膜基底膜中形成特殊的网状结构，为上皮细胞的黏附提供支架，而层粘连蛋白是大分子糖蛋白，主要作用可促进细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附，促进细胞分裂、铺展和细胞运动，提高细胞运动能力和趋化性，帮助细胞形成接触和伸展［31］。在本研究中，我们发现层粘连蛋白和IV 型胶原在RAD16-I 构建的细胞片中均阳性表达，且明显强于对照组。结合cadherin 的阳性表达，初步证实RAD16-I 自组装多肽水凝胶可以促进培养微环境中细胞-细胞和细胞-基质间的相互作用。

我们的结果表明，RAD16-I 自组装多肽水凝胶具有模拟细胞外基质微环境的能力，促进细胞的活力、增殖及胞间连接，从而可以有效地在dcECM表面快速形成复层上皮。尽管我们使用的材料均具有良好的生物相容性，但其安全性仍需进一步深入系统地探讨，同时RAD16-I 促进结膜上皮细胞复层的具体分子机制也是我们下一阶段的研究重点。