脑膜淋巴管在中枢神经系统疾病中作用和机制的研究进展*

莫 澜， 孟 波， 袁 桧， 刘荣君， 王瑞春， 陈骏萍，△， 卢 波△

（1宁波大学医学院，浙江 宁波 315211；2中国科学院大学宁波华美医院，浙江 宁波 315000）

淋巴系统承担着将来自全身组织的体液回收入心脏，辅佐激素、脂质等大分子物质入血以及免疫监视从而控制感染扩散的角色，对维持体液平衡和内环境稳态至关重要。淋巴管是淋巴系统中不可或缺的组成部分之一，人体绝大多数器官通过淋巴管清除来自细胞产生的代谢废物。过去人们普遍认为，由于大脑缺乏淋巴管体系，故其为一个特殊的免疫豁免器官，大脑如何清除脑代谢废物也一直是个未解之谜，直至2015年在小鼠脑被膜的最外层，即硬脑膜中发现了脑膜淋巴管（meningeal lymphatic ves‑sels，MLVs）这一结构，并证实这些管路能直接将脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）引流至外周的颈深淋巴结（deep cervical lymph nodes，DCLNs）处［1-2］，这一颠覆性的发现随即引发了关于这一过程潜在机制的探讨。随后Absinta等［3］于2017年使用磁共振成像技术（magnetic resonance imaging，MRI）观察到人类和灵长类动物同样存在MLVs。自此有越来越多的国内外学者开展一系列针对该结构与中枢神经系统疾病之间联系的研究。本文围绕MLVs 的解剖和功能展开，进一步探讨MLVs与CSF 引流及胶质淋巴系统（glymphatic system）的关系，总结了近年来MLVs与中枢神经系统疾病的相关研究成果，并阐述了目前已知的MLVs调控这些中枢神经系统疾病的作用机制。

1 MLVs的解剖和功能

淋巴管是由淋巴内皮细胞（lymphatic endothelia vessels，LECs）构成的单向流动管路。LECs特异性表达prospero相关同源异形盒1（prospero-related homeo‑box-1，PROX-1）、淋巴管内皮透明质酸受体1（lym‑phatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1，LYVE-1）和血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3），调控淋巴管的生长发育。2015年Louveau等［1］和Aspelund等［2］相继独立报道了淋巴管存在于小鼠的硬脑膜窦血管周围。基于LECs 的特性，Louveau 等［1］对小鼠硬脑膜进行LYVE-1 免疫染色标记，发现硬脑膜窦血管周围存在LYVE-1+的管路，并观察到内部含有CD3e+的T 细胞，证实了脑膜中存在淋巴管网络；接着向小鼠的枕池中注射Evans blue 行CSF 染色，观察到淋巴管和DCLNs逐一被染色，而切除DCLNs会造成脑膜中的T细胞数增多，进一步证明这些管路具备引流CSF和免疫细胞至外周淋巴结的功能。Aspelund 等［2］通过类似的免疫标记方法不仅仅在小鼠的上矢状窦旁检测到淋巴管，还在筛板、乙状窦、横窦、鼻嘴静脉、脑膜中动脉和翼腭动脉等周围均显示出淋巴管的存在，并证实它们能从蛛网膜下腔吸收脑内的脑间质液（interstitial flu‑id，ISF）和CSF，转运至下游DCLNs。因这些淋巴管独特的解剖结构，故称之为MLVs。

MLVs 由完全分化的低LECs 排列而成，相比外周淋巴管而言更加细小，而且缺乏防止淋巴倒流的瓣膜结构［1-2］。根据颅脑解剖特点可将MLVs 划分为沿上矢状窦及横窦走行的颅背侧MLVs 和沿岩窦及乙状窦走行的颅底侧MLVs，后者较前者的管路更为丰富并且含有清晰的淋巴管瓣膜，在CSF 引流中发挥主要作用［4-5］，前者则具备更强的介导炎症因子、T细胞、树突状细胞进入外周系统的免疫功能［6-7］。

Antila 等［8］对不同时期小鼠的硬脑膜进行免疫荧光标记，观察到与胚胎时期就开始发育的外周淋巴系统不同，MLVs 是在出生后发育形成的，它们首先出现在颅骨和椎管底部的孔周，然后沿着动静脉、脑神经和脊神经延至脑膜的各个区域。此外，基于血管内皮生长因子受体C（vascular endothelial growth factor receptor-C，VEGFR-C）主要表达于血管平滑肌细胞以及VEGFR-3 作为VEGF 的酪氨酸激酶受体主要表达于淋巴管内皮细胞的特性，该团队在成年小鼠身上进行了相关研究，发现VEGF-C或VEGFR3缺失会使MLVs 消退，从而损害其引流CSF 的功能，而过量的VEGF-C 能诱导MLVs 生成［8］。这些证据表明，MLVs 具备一定的可塑性和再生能力，或许能通过MLVs塑型来调控某些CNS疾病的病理生理过程。

2 MLV、CSF引流及glymphatic系统三者的关系

在发现MLVs 之前就已经有研究报道能在DCLNs 中检测到注入CSF 或脑实质中的荧光标记物［9-10］。 近年来实时成像技术显示MLVs 能吸收CSF［6］，而剥夺VEGF-C 或化学消融消除MLVs 会大大减少DCLNs 中的荧光标记物［5，8］。这些证据均说明MLVs具备引流CSF 至外周淋巴结的功能，提示我们MLVs 结构和功能的改变可能是CNS 疾病的进展机制之一。但缺失MLVs 的小鼠与正常小鼠的CSF压力无明显差异［2，6］，所以MLVs 在被破坏后，其引流CSF的功能也许会被其他CSF引流途径所代偿。

2012年，Iliff等［11］向小鼠枕池中注射荧光标记物标记CSF，然后使用双光子显微镜观察这些荧光标记物的走向表明：CSF能穿过动脉周围的血管旁间隙进入脑实质，与脑ISF对流交换后一并从静脉旁的血管周围间隙流出，起到清除包括淀粉样蛋白在内的脑代谢废物的作用，由于这一途径与外周淋巴系统在功能上相似，且受星形胶质细胞终板上的水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）极化的正向调控，故将其命名为glymphatic 系统。血管旁间隙由星形胶质细胞的终板围绕血管构成，AQP4 高度表达于终板上，敲除小鼠AQP4基因会导致从蛛网膜下腔流入脑实质内的CSF 及从脑实质流出的ISF减少，也陆续有研究报道该系统还受昼夜节律、年龄、睡眠、呼吸、脉搏、体位及MLVs 等影响［11-17］。尽管破坏小鼠MLVs 后并不影响其颅内CSF 含量，但敲除AQP4基因的小鼠脑部含水量增加［12］，提示由glymphatic 系统通过AQP4介导调节CSF-ISF对流参与维持颅内液体稳态。

总之，glymphatic系统在脑ISF和CSF的溶质交换中起着关键作用，有助于脑代谢废物通过CSF排泄出大脑，MLVs能够将CSF引流至外周的DCLNs，故从理论上推断，glymphatic 系统、MLVs及DCLNs共同构成了一条新的颅内至外周的引流途径，参与CSF循环和脑代谢废物运输，见图1。然而，该条途径是否真实存在及其对CSF引流的影响程度目前仍有待考究。

3 MLVs与中枢神经系统疾病

尽管研究人员一直在努力探索中枢神经系统疾病的病理生理机制，但仍存在诸多未解之谜。近年来，MLVs 的发现为探寻中枢神经系统疾病的发生、发展及预后的本质原理打开了一扇全新的大门。

Figure 1.Diagram of cerebral waste excretion through the glym‑phatic system-meningeal lymphatic vessels（MLVs）-deep cervical lymph nodes（DCLNs）pathway.图1 脑代谢废物经glymphatic 系统-MLVs-DCLNs 途径排泄示意图

3.1 MLVs 对神经退行性疾病的影响既往研究表明，老龄小鼠颅内CSF 从MLVs的流出量较年轻小鼠明显减少［5］，提示MLVs 可能参与年龄相关神经退行性疾病的病理生理过程。阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是目前全球范围内最常见的认知功能障碍疾病，β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）大量沉积在神经元周围和Tau 蛋白在神经元内部聚集是其主要的病理标志［18］。值得关注的是，后者能从完整的神经元中通过囊泡释放和胞吐释放等方式进入CSF 中［19］，即二者均可在一定程度上跟随脑脊液流动。向因衰老导致覆盖面积减少和内径缩小的MLVs 局部注入重组VEGF-C 可改善MLVs 引流CSF的能力，从而使得MLVs 对包括Aβ 和Tau 蛋白在内的大分子物质的清除能力增强，进一步减缓年龄相关认知障碍的发生［20-21］。新近研究显示，上调唐氏综合征关键区域1（Down syndrome critical region 1，DSCR1）能扩张MLVs从而增强其引流Aβ的能力，该机制主要与DSCR1 抑制钙调磷酸酶/NFAT 信号通路从而调节内皮细胞生长发育和存活相关［22］。此外，研究人员选用缺乏MLVs 的K14-VEGFR3-Ig 转基因小鼠作为实验小鼠，向其脑实质中注射荧光素标记的tau 蛋白，于48 h 和72 h 观察实验组小鼠的脑实质中Tau 蛋白含量远高于对照组小鼠，且血浆中的tau蛋白含量较低，所以维持MLVs的正常解剖学形态有助于清除神经元周围的tau蛋白［23］。

帕金森病（Parkinson disease，PD）也是一种常见的年龄相关的神经系统退行性疾病，α-突触核蛋白（α-synuclein，α-Syn）过度蓄积是PD 发生及进展的中心环节［24］。通过结扎小鼠DCLNs 间接阻断MLVs的引流，可增加颅内α-Syn 的蓄积以及胶质细胞活化，从而加重了小鼠帕金森样症状［25］。另一团队则使用动态对比增强MRI检测出，特发性PD 患者流经乙状窦和上矢状窦旁MLVs中的流量比非典型PD 患者的显著减少，并且也在动物研究中证实了MLVs障碍可增加α-Syn蓄积，加速PD进展［26］。

上述研究表明，MLVs 功能异常导致颅内Aβ、Tau 及α-Syn 清除障碍，促进Aβ、Tau 及α-Syn 异常病理蛋白沉积对中枢神经系统的毒性作用，进而加速了神经退行性疾病的病程进展，未来通过调控MLVs引流功能有望成为因颅内大分子代谢废物堆积所致神经系统疾病的治疗策略。

3.2 MLVs对颅脑损伤的影响Bolte等［27］在轻度创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）小鼠模型上的研究指出，先前存在的MLVs 障碍会加重TBI 所致中枢炎症和认知障碍，并且TBI 可诱导原本正常小鼠的MLVs 引流功能受损，其机制可能与TBI 引起脑组织水肿、颅内压升高压迫MLVs 有关；利用激光毁损MLVs后可观察到小胶质细胞活化增加，而通过腺病毒转染VEGF-C 增大MLVs内径可逆转TBI诱导的小胶质细胞活化表达。

硬膜下血肿（subdural hematoma，SDH）的清除机制尚不清楚。基于MLVs独特的引流特性，研究人员通过向鼠的硬膜下腔注射FITC-500D、A488-纤维蛋白原和自体血来建立SDH 动物模型，证明SDH 中的红细胞和纤维蛋白原经MLVs引流至DCLNs中，阻断MLVs 引流途径将抑制血肿吸收；同时SDH 可引发MLVs 生成相关蛋白LYVE1、FOXC2 和VEGF-C 表达下调进而抑制MLVs 的功能，不过被抑制的MLVs 功能后期也会随着血肿的吸收而逐渐恢复［28］。由此可见，颅脑损伤与MLVs引流功能相互影响，预防及改善MLVs损伤将有希望成为治疗颅脑损伤的新手段。

3.3 MLVs 对脑卒中（stroke）预后的影响脑卒中分为由动脉破裂引发的出血性脑卒中和动脉阻塞引起的缺血性脑卒中两类，针对出血性脑卒中，目前已有研究证实MLVs 参与引流蛛网膜下腔出血（sub‑arachnoid hemorrhage，SAH）后CSF 中的红细胞至外周组织，从而减轻蛛网膜下腔出血对大脑的损害，除此之外，毁损MLVs 可检测到全脑CD16/32+（M1 型）CD206−（M2 型）小胶质细胞百分率显著升高，加重SAH 后中枢炎症对神经系统的损害［29］。 故扩张MLVs管径和修复因衰老等原因受损的MLVs是改善蛛网膜下腔出血预后的新的研究方向。

针对缺血性脑卒中的研究显示，对年轻雄性C57BL/J6小鼠使用光栓（photothrombosis，PT）法建立脑缺血模型可导致小鼠的MLVs生成，而使用短暂性大脑中动脉闭塞法（transient middle cerebral artery oc‑clusion，TMCAO）建立的小鼠模型的MLVs 的直径增加但覆盖率无明显变化［30］，这可能是由于前者在利用激光照射造模过程中引起脑膜中小血管闭塞所致。有意思的是，在VEGFR3信号能够促进淋巴管的生长发育和VEGFR3突变可使得MLVs 退化的基础上，建立针对这两种不同模型的VEGFR3突变小鼠，却只加重TMCAO模型的脑卒中严重程度。以上两种现象揭示了缺血性脑卒中和MLVs会相互影响，但也提示将来研究MLVs在缺血性脑卒中病理生理过程中的机制时，模型的选择需要相应研究人员更多的考虑。

3.4 MLVs 对脑肿瘤的影响研究人员对人体颅脑标本进行免疫组织化学染色显示：来自颅内的淋巴管穿过颈静脉孔周围的硬脑膜与颈内静脉周围的颈深淋巴管网相连通［31］，以此推测这可能是人体肿瘤发生脑转移以及脑肿瘤扩散至身体其它部位的可能途径。在此之前，Hu 等［7］在小鼠硬脑膜下或纹状体中注射GL261 或B16 细胞建立小鼠脑瘤模型观察到脑胶质瘤或转移性黑色素瘤可引起小鼠颅背侧MLVs 广泛重塑和新生成；使用特异性药物Visudyne对颅背侧MLVs化学消融后，可阻止脑肿瘤中的树突状细胞转移至DCLNs，降低抗PD-1/CTLA-4 联合免疫疗法的疗效。为进一步探寻MLVs 对脑肿瘤影响的内在机制，该团队还通过对患脑肿瘤小鼠过表达VEGF-C 观察到其对抗PD-1/CTLA-4 联合免疫疗法的反应性增强，并且在阻断CCL21/CCR7的条件下所抑制，说明颅背侧MLVs 可通过VEGF-C-CCL21/CCR7 信号通路介导树突状细胞从脑肿瘤中转移到DCLNs。这一研究提示MLVs 或许是人体大脑和其他部位的肿瘤在进展期发生相互转移的途径之一，可能成为脑肿瘤免疫治疗的新目标。

3.5 MLVs 对多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）的影响MS 是一种中枢神经系统炎症性疾病，T 细胞在其免疫损害机制中扮演着重要的角色。生理状态下，脑膜中存在丰富的免疫细胞，其中T 细胞可进入MLVs 中，鉴于T 细胞在淋巴管中的运输主要依赖于CCR7-CCL21 途径，对比CCR7基因敲除小鼠的DCLNs 中T 细胞数量显著少于野生型小鼠，证实了CCR7 在脑膜T 细胞运输中的作用［32］。值得关注的是，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental au‑toimmune encephalomyelitis，EAE）即MS 小鼠模型中，消融MLVs 可导致脑源性特异性T 细胞产生受损及T 细胞进入脊髓受阻，同时小鼠的瘫痪程度明显减轻［1，6］。尽管目前关于中枢炎症与MLVs 的具体机制仍不清楚，但EAE 小鼠试验向我们展示了阻断MLVs可能防止抗原和APC 进入颈部淋巴结，从而限制外周通过CD4+T细胞获取致病原。

3.6 MLVs 对肝性脑病（hepatic encephalopathy，HE）的影响HE 是肝硬化患者的严重神经系统并发症。结扎4 周龄大鼠胆管建立肝硬化合并HE 模型，检测其中枢炎症、运动功能、MLVs形态及功能变化，表明肝硬化大鼠运动功能减退的同时伴有大脑皮层中炎症因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α和IBA1表达水平显著升高，通过诱导MLVs 生成、促进MLVs 引流可提高上述炎症因子的清除率，可改善HE的相关症状［33］。该研究结果对今后制定肝性脑病的临床治疗策略具有一定指导意义。

4 总结与展望

综上所述，脑膜中存在表达LECs 经典淋巴标志物的MLVs，该结构独特的解剖学特性沟通了大脑和外周淋巴组织，在CSF 引流、脑代谢以及中枢神经系统免疫中起着至关重要的作用。MLVs 受到年龄、VEGF-C 和中枢神经系统疾病等多因素的影响，具备一定的可塑性及再生能力，改善其功能有望成为多种中枢神经系统疾病的潜在预防及治疗靶点。但目前关于MLVs功能的相关的研究多局限于动物实验，缺乏临床试验数据，对于MLVs在中枢神经系统疾病中的作用和机制探索也尚处起步阶段，仍需大量的工作对其进行深入的探索和研究。

此外，尽管MLVs 目前被称为“脑膜淋巴管”，有时也称之为“脑淋巴管”，并常直接归类于脑淋巴管系统的一部分，但从解剖学及生理学层面来说，硬脑膜位于中枢神经系统的血脑屏障之外，这些术语可能会导致一定的误解。随着探索的不断深入，未来应对这些淋巴管路的解剖及病理生理功能做出更为详尽的描述和更准确的定义。