慢性阻塞性肺疾病小鼠模型制备方法的比较研究*

梅晓峰， 赵 鹏，3， 卢瑞龙， 崔莉莉， 田燕歌，3， 李建生，3△

（河南中医药大学1呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，2河南省中医药防治呼吸病重点实验室，3中医药科学院，河南 郑州 450046）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo‑nary disease，COPD）是一种以持续气流受限为特征的可预防和治疗的疾病［1］。据世界经济论坛评估，2030 年，COPD 全球经济负担将达每年50 万亿美元［2］。COPD 已成为威胁公众健康的第三大死亡原因疾病［3］，香烟烟雾（cigarette smoke，CS）暴露、细菌及病毒感染均是诱发和加重COPD 的重要因素。COPD 病理机制复杂，动物模型是阐释发病机制、寻找有效药物的重要工具。因此，建立稳定可靠的COPD模型具有重要意义。

大鼠、豚鼠、小鼠和雪貂等常用于制备COPD 模型，其中小鼠具有成本低、体积小、易于饲养和基因组改造技术成熟等优势，是复制人类疾病模型的最常用动物［4］。COPD 模型制备的方法主要包括CS 熏吸、气管内滴注细菌或脂多糖及吸入SO2等［5-6］，但大多方法周期长，病变持续时间短。本课题组前期成功建立了香烟联合肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneu⁃moniae，KP）感染的大鼠模型，具有成模早，病理表现接近临床，且病变持续时间长的优势［7］。本研究在前期工作基础上，综合多种致病因素，采用CS 暴露、KP 感染、聚肌胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，Poly I：C）滴鼻、CS 暴露联合KP 感染和CS 联合Poly I：C 滴鼻5 种方法建立COPD 模型，通过比较单一及复合致病因素的致病特点及病变程度，以期建立一种稳定可靠、且与临床病理特征相符合的小鼠模型，为深入研究COPD 的发病机制及药物作用机制提供依据。

材料和方法

1 动物和细菌

SPF级BALB/c小鼠288只，雄性，体重（20±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为110011200106861568，许可证号为SCXK（京）2016-0006。本研究通过河南中医药大学实验动物福利伦理审查委员会审查批准（伦理审查批号为DWLL202003210）。

肺炎克雷伯杆菌（货号46114）购自中国生物制品检验鉴定所，使用前将细菌浓度调整为5×109CFU/L（预实验确定）。

2 实验材料、试剂和仪器

红旗渠过滤嘴香烟（烤烟型，焦油量10 mg，烟气烟碱量0.8 mg，烟气一氧化碳量12 mg）由河南中烟工业有限责任公司生产；Poly I：C（货号tlrl-picw-250）购自Invivogen，每次使用前将浓度调至1.25 g/L（预实验确定）；小鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis fac‑tor-α，TNF-α）ELISA Kit（货号555268）和小鼠白细胞 介 素6（interleukin-6，IL-6） ELISA Kit（ 货 号555240）购自BD；小鼠基质金属蛋白酶2（matrix me‑talloproteinase-2，MMP-2） ELISA Kit（ 货 号E-ELM0780c）购自Elabscience。 动物肺功能检测系统（FinePointe PFT）；全波长酶标仪（Multiskan GO）；样品破碎系统（TissueLyser Ⅱ）；高速台式冷冻离心机（D-37520）。

3 方法

3.1 分组将288只SPF级BALB/c小鼠随机分为6组：空白组（normal 组）、CS 组、细菌组（KP 组）、CS 联合KP 组（CS+KP 组）、Poly I：C 组和CS 联合Poly I：C组（CS+Poly I：C组），每组48只。

3.2 小鼠模型的制备第1～8 周，CS 组单用CS 熏吸，KP组单用KP（每只1×105CFU）滴鼻，CS+KP组采用CS 熏吸联合KP 滴鼻，Poly I：C 组单用Poly I：C（每只25 μg）滴鼻，CS+Poly I：C 组采用CS 熏吸联合Poly I：C 滴鼻。CS 熏吸方法：将小鼠放入熏烟箱，点燃香烟，使烟雾浓度达到（30±5）%进行烟雾熏吸，每次40 min，每天2次。KP 和Poly I：C 经鼻滴注，每7 d 1次，共8周。

分别于第4周（造模4周）、第8周（造模8周）、第16 周（停止造模8 周）及第24 周（停止造模16 周）取材。

3.3 肺功能测定分别于第0、4、8、12、16、20 和24周采用小动物全身体积描记检测系统检测小鼠50%潮气量呼气流量（50% tidal volume expiratory flow，EF50）和呼气峰流速（peak expiratory flow，PEF）等指标。

3.4 肺组织病理学观察采用10 %中性甲醛固定肺组织，72 h 后进行石蜡包埋及HE 染色。每张肺组织切片随机截取6 个肺泡视野图片，在图片中央画出“十”字，计算每个视野的肺泡数（alveolar number，Na）、肺泡隔膜数（septum number，Ns）、测量长度（length，L）和面积（size，S），计算公式如下：肺泡平均截距（mean linear intercept，MLI；μm）=L/Ns，平均肺泡数（mean alveolar number，MAN；mm−2）=Na/S［8］。

3.5 ELISA 检测肺组织中TNF-α、IL-6 和MMP-2 水平将小鼠右肺分离后，50 mg 肺组织匀浆取上清，根据ELISA 试剂盒说明书检测小鼠肺组织中TNFα、IL-6和MMP-2的水平。

3.6 R 值综合评价采用R值综合评价法［9］分别对各时点小鼠肺功能、肺组织病理、炎症和蛋白酶指标进行R值综合评价（R综合），比较5 种造模方法对COPD 小鼠的病变程度。R综合值大于CS 组R综合值说明病变程度强于CS 组，R综合值小于CS 组说明病变程度弱于CS组。

4 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差（mean±SD）描述。多组间比较采用方差分析，各组均数间的两两比较采用SNK-q检验。当P<0.05时认为差异有统计学意义。

结 果

1 肺功能

第4 周，与normal 组比较，CS+KP 组的PEF 显著降低（P<0.05）；第8 周和第12 周，与normal 组比较，CS 组、CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的PEF 和EF50 显著降低（P<0.05），KP 组和Poly I：C 组的PEF 显著降低（P<0.05）；第16 周，与normal 组比较，CS 组、CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的PEF 和EF50 均 显 著降低（P<0.05）；第20 周和第24 周，与normal 组比较，CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的PEF 和EF50 显著降低（P<0.05），见表1、2。

表1 不同时点各组小鼠PEF的变化Table 1.The changes of PEF in each group at each time point（mL/s.Mean±SD. n=8 to12）

表2 不同时点各组小鼠EF50的变化Table 2.The changes of EF50 in each group at each time point（mL/s.Mean±SD. n=8 to 12）

2 肺组织病理变化

HE 染色结果显示，normal 组小鼠肺组织结构正常，未见病理改变；造模8 周后，CS 组、CS+KP 组和CS+Poly I：C 组小鼠肺组织出现大量炎症细胞浸润、肺泡腔扩张、肺泡壁断裂融合、气管壁增厚等病理变化，KP 组和Poly I：C 组小鼠肺组织仅出现炎症细胞浸润、肺泡腔扩张，见图1。

Figure 1.The pathological changes in lung tissues of mouse in each group at each time point（HE staining，×200）.图1 不同时点各组小鼠肺组织的病理变化

第4周，与normal组比较，CS+KP 组的MAN 显著降低，MLI显著升高（P<0.05）；第8周，与normal组比较，CS 组、CS+KP 组和CS+Poly I：C 组MAN 显著降低，MLI显著升高，KP组和Poly I：C组的MAN显著降低，CS+KP 组较KP 组和Poly I：C 组的MAN 显著降低（P<0.05）；第16 周，与normal 组比较，CS+KP 组和CS+PolyI：C 组的MAN 显著降低，MLI 显著升高，CS组的MAN 显著降低（P<0.05）；第24 周，与normal 组比较，CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的MAN 显著降低，MLI 显著升高，CS+KP 组较CS 组和KP 组和Poly I：C组的MLI显著升高（P<0.05），见表3、4。

表3 不同时点各组小鼠平均肺泡数的变化Table 3.The changes of MAN in each group at each time point（mm−2.Mean±SD. n=8 to 12）

3 肺组织中TNF-α和IL-6的变化

第4 周，与normal 组比较，CS+KP 组的TNF-α 和IL-6 显著升高（P<0.05）；第8 周，与normal 组比较，CS 组、CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的TNF-α 和IL-6 均显著升高，KP 组的TNF-α 显著升高，CS+KP 组较CS组的IL-6 显著升高，较KP 组和Poly I：C 组的TNF-α和IL-6 显著升高，CS+Poly I：C 组较CS 组、KP 组和Poly I：C 组的IL-6 显著升高（P<0.05）；第16 周，与normal 组比较，CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的TNF-α和IL-6均显著升高，CS组、KP 组和Poly I：C 组的IL-6显著升高，CS 组较KP 组和Poly I：C 组的IL-6 显著升高，CS+KP组和CS+Poly I：C组较CS组的TNF-α显著升高，较KP 组和Poly I：C 组的TNF-α 和IL-6 显著升高（P<0.05）；第24 周，与normal 组比较，CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的TNF-α 和IL-6 显著升高，CS+KP 组较CS 组、KP 组和Poly I：C 组的IL-6 显著升高（P<0.05），见表5、6。

表5 不同时点各组小鼠肺组织中TNF-α水平的比较Table 5.Comparison of the levels of TNF-α in each group at each time point（ng/L.Mean±SD. n=8 to 12）

表4 不同时点各组小鼠肺泡平均截距的变化Table 4.The changes of MAN in each group at each time point（μm.Mean±SD. n=8 to 12）

表6 不同时点各组小鼠肺组织中IL-6水平的比较Table 6.Comparison of the levels of IL-6 in each group at each time point（ng/L.Mean±SD. n=8 to 12）.

4 肺组织中MMP-2的变化

第8 周，与normal 组比较，CS 组、KP 组、CS+KP组、Poly I：C 组和CS+Poly I：C 组的MMP-2 均显著升高，CS+KP 组和CS+Poly I：C 组较CS 组、KP 组和Poly I：C 组的MMP-2 显著升高（P<0.05）；第16 周，与nor‑mal 组比较，CS 组、KP 组、CS+KP 组、Poly I：C 组和CS+Poly I：C 组的MMP-2 显著升高，CS+KP 组较CS组、KP 组和Poly I：C 组的MMP-2 显著升高，CS+Poly I：C 组较KP 组和Poly I：C 组的MMP-2 显著升高（P<0.05）；第24 周，与normal 组比较，CS 组、CS+KP 组和CS+Poly I：C 组 的MMP-2 显著升高（P<0.05），见表7。

表7 不同时点各组小鼠肺组织中MMP-2水平的比较Table 7.Comparison of the levels of MMP-2 in each group at each time point（μg/L.Mean±SD. n=8 to 12）

5 R值综合评价

R值综合评价结果显示，造模4 周，CS+KP 组的R综合值较CS 组、KP 组和Poly I：C 组显著升高（P<0.05），各模型组的病变程度依次为CS+KP>CS>CS+Poly I：C>Poly I：C>KP；造模8 周，CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的R综合值较KP 组和Poly I：C 组显著升高（P<0.05），各模型组的病变程度依次为CS+KP>CS+Poly I：C>CS>KP>Poly I：C；第16 周，CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的R综合值较KP 组和Poly I：C 组显著升高，CS 组的R综合值显著高于Poly I：C 组（P<0.05），各模型组的病变程度依次为CS+KP>CS+Poly I：C>CS>KP>Poly I：C；第24 周，CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的R综合值较CS 组、KP 组和Poly I：C 组显著升高，CS 组的R综合值显著高于Poly I：C组（P<0.05），各模型组的病变程度依次为CS+KP>CS+Poly I：C>CS>KP>Poly I：C；综合所有时点R值结果显示，与CS 组比较，KP组和Poly I：C 组的R综合值显著降低，CS+KP 组和CS+Poly I：C 组的R综合值较CS 组、KP 组和Poly I：C 组显著升高（P<0.05），见表8。

表8 不同时点各组小鼠指标R值综合评价Table 8.The changes of comprehensive R values in each group at each time point and all time points（Mean±SD. n=7）

讨 论

COPD 的发病率和死亡率在世界范围内呈上升趋势，其特点是慢性气道炎症、不可逆气流受限和肺功能的加速下降。诱发和加重COPD 的环境危险因素主要包括吸烟、细菌病毒感染、职业性粉尘和空气污染等。临床上90% 的COPD 患者为吸烟者或曾有吸烟史［10］。吸烟可损伤上皮组织，引起炎症细胞向黏膜、黏膜下层和腺体组织浸润，诱发杯状细胞和基底细胞增生、鳞状上皮细胞化生、细胞外基质沉积增多，导致气道重塑引起气流受限［11-12］。此外，呼吸道感染是COPD 发病和加重的主要原因，与非感染性COPD 患者相比，细菌和病毒感染者的住院周期延长、低氧血症和肺功能恶化程度加重、死亡率升高［13-16］。常见的感染细菌为流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和卡他莫拉菌，常见的病毒为单链RNA 病毒，如鼻病毒、副流感病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒［17-18］。

文献中多采用单纯CS 熏吸［19］、气管内滴注弹性蛋白酶［20］、CS联合脂多糖［21］及CS联合细菌或病毒［22］构建COPD 动物模型，但存在诸多不足，如造模周期较长、病理改变不稳定、无法较好模拟COPD 临床特征。活病毒用于动物模型的制备具有一定的风险、不易质控的局限性。Poly I：C 是双链核糖核酸的合成类似物，结构明确、无传染性、易于操作，可模拟呼吸道病毒感染复制的中间产物，诱发机体损伤，体内外研究常用Poly I：C 模拟RNA 病毒感染作用［23-24］。本课题组前期采用CS 熏吸联合细菌感染成功模拟COPD 大鼠模型，造模8周即可呈现COPD 病理特征，观察至第32 周，病变特征稳定。本研究以经济、个体差异小的近交系小鼠为研究对象，通过比较CS、肺炎克雷伯杆菌和Poly I：C 单因素及复合因素诱导的COPD 模型，以期建立一种简单、稳定、安全有效且成模周期短的造模方法。

肺功能和肺组织病理改变是COPD 动物模型制备的重要评价标准［25］。其中，无创肺功能的测定可动态监测气道阻塞、肺容积、传导性和通气参数等变化，如EF50 反应气道阻塞严重程度，潮气量反应肺容积变化；PEF 反应传导性变化，每分钟通气量反应通气情况变化等［26］。肺组织病理改变作为评价COPD 模型的标准之一，可反映气道和肺组织病变的严重程度［27］。王玮等［28］采用香烟联合气道滴入脂多糖发现造模12 周各模型组大鼠在肺功能和肺病理方面出现COPD 的典型病理变化。炎症反应和蛋白酶-抗蛋白酶失衡是COPD 的主要病理机制［29-30］。CS、细菌和病毒等致病因素侵入机体，刺激上皮细胞、肺泡巨噬细胞和T 细胞等产生多种炎症因子，如TNF-α、IL-6 和IL-β 等，诱发炎症反应级联放大［31-33］，并引起各种蛋白酶失衡，促进巨噬细胞向肺实质及气道聚集，诱导结构改变，导致肺气肿的形成，促进COPD发生发展［34］。

本研究结果显示，造模4 周后，CS 联合细菌可降低小鼠肺功能，提高炎症因子水平，CS 联合细菌或Poly I：C 组肺组织出现病理损伤；造模8 周后，各模型组小鼠均出现COPD 典型病理变化，肺功能显著降低，炎症因子TNF-α、IL-6 和MMP-2 显著升高；停止造模8 周后，各模型组病理变化依然存在；停止造模16 周后，CS 联合细菌或Poly I：C 组病理变化仍持续存在。R值综合评价结果显示，造模4 周CS 联合细菌组即可出现COPD 病理特征；造模8 周CS 联合细菌或Poly I：C 组病理特征重于CS、细菌和Poly I：C组，且病理损伤可持续至停止造模后16周。

综上所述，CS、细菌和Poly I：C 及其联合均可以不同程度的引起小鼠肺功能下降、肺病理损伤，其中CS 联合细菌或Poly I：C 组病理特征出现早、明显、持续时间长，其病理学特征类似于COPD 患者，适用于发病机制的防治研究。