平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠模型的构建*

张燕红， 黄 山， 高诗娟， 李玉琳， 杜 杰△

（1山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西 太原 030001；2首都医科大学附属北京安贞医院，北京市心肺血管疾病研究所血管生物研究室，北京 100029）

混合谱系激酶3（mixed lineage kinase 3，MLK3）又被称为MAP3K11（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11），是一种分子量为97 kD 的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于丝裂原活化蛋白激酶（mito‑gen-activated protein kinase，MAPK）级联途径的重要分子，接收多种来自细胞表面受体的信号传导，包括受体酪氨酸激酶、趋化因子受体和细胞因子受体等，通过磷酸化并活化MAPK 激酶，介导下游MAPK 成员c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 和细胞外信号调节激酶的活化，参与调节细胞增殖和细胞凋亡等［1-2］。研究证实MLK3 在心血管疾病的发生发展中发挥重要作用，如MLK3基因敲除鼠心功能下降，血压升高［3-4］，MLK3基因缺失促进小鼠血管内膜新生等［5］。鉴于MLK3 广泛表达于心脏、主动脉、肺和肝等多种组织细胞中，为特异性探索心血管疾病发生过程中MLK3 在血管平滑肌细胞中的作用与机制，本研究利用Cre/loxP 重组酶系统，构建了平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠，为后期研究奠定基础。这种基于平滑肌细胞特异性敲除MLK3的小鼠模型目前还未见报道。

材料和方法

1 仪器和试剂

鼠尾裂解液DirectPCR Lysis Reagent 购于Via‑gen Biotech；蛋白酶K 购于TIANGEN；抗MLK3 抗体购于CST；抗肌球蛋白重链11（myosin heavy chain 11，Myh11）抗体购于武汉塞维尔公司。采用Bio-Rad 凝胶成像分析仪采集DNA 图像；采用Leica 激光共聚焦显微镜（TCS 4D）采集免疫荧光图像；采用北京软隆公司的小动物血压监测仪（BP-2010A）测定小鼠血压；采用深圳雷杜公司的全自动生化分析仪（Chemray 800）分析小鼠外周血生化指标。

2 方法

2.1 平滑肌细胞特异性MLK3 基因敲除小鼠的构建首先构建MLK3-loxP 转基因小鼠（MLK3wt/fl），步骤如下：构建靶向MLK3基因4～8 号外显子两端的基因打靶载体，并电转至胚胎干（embryonic stem，ES）细胞，筛选Southern 阳性的ES 克隆进行胚胎显微注射，最终获得MLK3wt/fl小鼠（由赛业生物科技有限公司协助完成）。将MLK3wt/flF0 代成年小鼠与携带平滑肌细胞特异表达Cre 重组酶的Tagln-Cre 小鼠（赛业公司惠赠）交配，得到F1 代Tagln-Cre/MLK3wt/fl小鼠，F1 代之间交配，得到MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠，对照组为MLK3fl/fl/WT。实验小鼠均饲养在SPF 级环境，清洁饮食，温湿度适宜。本实验得到北京安贞医院伦理委员会批准。

2.2 小鼠基因型的鉴定收集杂交后子代小鼠鼠尾，加入蛋白酶K 和鼠尾裂解液（1∶100）的混合液100 μL，56 ℃消化过夜，85 ℃变性30 min，提取基因组DNA 并进行PCR 扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定小鼠基因型。PCR 扩增引物如下：MLK3-loxP 的上游引物序列为5'-CAACACTGAAAACGGC‑CACATTA-3'，下游引物序列为5'-AAAGGGAACAT‑GCTTGTGAGTCT-3'；Tagln-Cre 的上 游引 物序 列为5'AGGTGGCTTGTTTGTCCC-3'，下游引物序列为5'-CGCCGCATAACCAGTGAAACAG-3'。PCR 退火温度为59 ℃。

2.3 免疫荧光检测血管平滑肌细胞MLK3的表达分离经基因型鉴定为MLK3fl/fl/WT 和MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠的主动脉，制备冰冻切片，室温晾干后，4%多聚甲醛固定，PBS洗后，室温封闭，加入抗MLK3的抗体及抗血管平滑肌细胞标志物Myh11抗体，4 ℃孵育过夜，荧光II 抗染色，室温40 min，DAPI 封片液封片。激光共聚焦显微镜采图。

2.4 免疫组化检测血管平滑肌细胞Myh11 的表达分离经基因型鉴定为MLK3fl/fl/WT 和MLK3fl/fl/Tagln-Cre小鼠的主动脉，制备石蜡切片，脱蜡后抗原修复，3% 双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶，血清封闭后加入抗Myh11 的抗体，4 ℃孵育过夜，室温平衡30 min，PBS 洗后加入Ⅱ抗，室温50 min，PBS 洗后DAB 显色，苏木素复染，甘油明胶封片。图像采集分析，统计阳性面积比率。

2.5 小鼠血压的测定使用BP-2010A 智能无创血压计测量血压：将小鼠固定在配有鼠网的鼠袋中，放于保温筒上保持恒温，将传感器置于小鼠的尾根部，连续测量血压后取平均值。

2.6 小鼠血糖和血脂的检测收集MLK3fl/fl/WT 和MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠的外周血，4 ℃、3 000 r/min 离心10 min，取上清液，用全自动生化分析仪自动测定葡萄糖（glucose，Glu）、糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）、甘油三脂（triglyceride，TG）、总胆固醇（cholesterol，CHO）、高密度脂蛋白（high-den‑sity lipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（low-density li‑poprotein，LDL）等指标。

3 统计学处理

使用GraphPad Prism 8 软件进行数据统计分析。组间比较采用t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 平滑肌特异性MLK3基因敲除小鼠的构建

利用ES 细胞基因打靶技术在MLK3基因第4～8外显子两端插入loxP 位点以制备MLK3wt/fl小鼠，将其F0 代成年小鼠与携带平滑肌细胞特异表达Cre 酶的Tagln-Cre 小鼠交配，得到F1 代MLK3wt/fl/Tagln-Cre 小鼠，F1 代之间交配，得到MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠，对照组为MLK3fl/fl/WT，见图1。

Figure 1.Schematic diagram of the generation of smooth muscle cell-specific MLK3 knockout mice.图1 平滑肌特异性MLK3基因敲除小鼠构建示意图

2 平滑肌特异性MLK3基因敲除小鼠基因型的鉴定

鼠尾基因组DNA 经PCR 扩增后，经2% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。图2A是对MLK3-loxP序列扩增的结果，野生型MLK3 片段为219 bp，MLK3-loxP 片段为341 bp；图2B 是对Tagln-Cre 序列扩增的结果，Tagln-Cre阳性小鼠可扩增得到929 bp的条带，而WT小鼠则无目的条带。上述鉴定结果表明，MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠即平滑肌特异性MLK3基因敲除小鼠。

Figure 2.Genotyping of MLK3fl/fl/Tagln-Cre mice.A：the electrophoresis bands of MLK3-loxP fragments；B：the electrophoresis bands of Tagln-Cre fragments.图2 平滑肌特异性MLK3基因敲除小鼠基因型的鉴定

3 免疫荧光证实敲除MLK3 基因的平滑肌细胞无相应蛋白表达

为了进一步验证平滑肌特异性MLK3基因敲除小鼠构建成功，我们将MLK3 及平滑肌细胞特异性标志物Myh11 进行免疫荧光共染，检测平滑肌细胞中MLK3 的表达。如图3 所示，MLK3fl/fl/WT 小鼠主动脉平滑肌细胞表达MLK3，而MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠主动脉平滑肌细胞几乎检测不到MLK3 的表达。此结果表明平滑肌细胞特异性敲除MLK3成功。

4 免疫组化表明平滑肌敲除MLK3 导致收缩标志物Myh11表达下降

特异性敲除小鼠构建成功后，我们首先探讨MLK3敲除是否影响平滑肌细胞的收缩功能。为此，用免疫组化染色的方法检测了平滑肌细胞收缩标志物Myh11 的表达。如图4 所示，与MLK3fl/fl/WT 小鼠相比，MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠主动脉平滑肌细胞的Myh11 阳性面积百分比减少，表明平滑肌细胞特异敲除MLK3基因可能影响血管平滑肌细胞的收缩功能，具体的作用机制将在后续的研究中探讨。

5 平滑肌特异性MLK3 基因敲除小鼠基础状态下血压正常

Figure 3.Immunofluorescence analysis of MLK3 expression in smooth muscle cells from MLK3fl/fl/WT and MLK3fl/fl/Tagln-Cre mice.图3 免疫荧光检测平滑肌特异敲除MLK3基因后MLK3蛋白的表达

Figure 4.Immunohistochemical analysis of Myh11 expression in smooth muscle cells from MLK3fl/fl/WT and MLK3fl/fl/Tagln-Cre mice.Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs MLK3fl/fl/WT group.图4 免疫组化检测平滑肌细胞收缩标志物Myh11的表达

为了评价平滑肌细胞MLK3敲除是否影响了小鼠的基础表型，我们首先检测了小鼠血压情况。利用智能无创血压仪通过尾套法测定8～10 周龄小鼠收缩压（systolic blood pressure，SBP）及舒张压（dia‑stolic blood pressure，DBP），结果显示，MLK3fl/fl/Tagln-Cre 小鼠与MLK3fl/fl/WT 对照小鼠相比血压的差异无统计学显著性，见图5。

6 平滑肌特异性MLK3 基因敲除小鼠基础状态下血糖和血脂正常

Figure 5.Blood pressure of MLK3fl/fl/Tagln-Cre and MLK3fl/fl/WT mice.SBP：systolic blood pressure；DBP：diastolic blood pressure.Mean±SD. n=6.图5 平滑肌特异性MLK3基因敲除小鼠的血压

利用全自动生化仪检测了8～10 周龄MLK3fl/fl/Tagln-Cre 鼠与MLK3fl/fl/WT 对照鼠的血糖及血脂水平，结果如图6 所示。与MLK3fl/fl/WT 对照鼠相比，MLK3fl/fl/Tagln-Cre 鼠上述指标的差异无统计学显著性，说明基础状态下，平滑肌细胞特异性敲除MLK3不影响血糖及血脂等生化指标。

Figure 6.Plasma levels of lipids and glucose in MLK3fl/fl/Tagln-Cre mice.TG：triglyceride；CHO：cholesterol；HDL：high-density li‑poprotein；LDL：low-density lipoprotein；Glu：glucose；GSP：glycosylated serum protein.Mean±SD. n=6.图6 平滑肌特异性MLK3基因敲除小鼠的血糖和血脂

讨 论

MLK3 也被称为MAP3K11，于1994 年首次被发现［6］。MLK3 作为MAPK 信号通路的重要激酶，在多种组织及细胞中广谱表达，可调节细胞增殖、分化、凋亡等进程。其参与调控的生理及病理进程具有一定的组织特异性，从而在多种疾病包括肿瘤、神经退行性变及心血管疾病等的发生发展中发挥重要调控作用［7］。在肿瘤中，MLK3 促进癌细胞存活、迁移、耐药性和肿瘤免疫等，是乳腺癌、卵巢癌和结直肠癌的潜在治疗靶点［1］；在神经退行性疾病包括帕金森病和阿尔茨海默病等，MLK3通过激活JNK 介导神经元细胞死亡［8-9］。近年来，MLK3 在心血管病的发生发展中的作用受到关注。MLK3 在肥厚性心肌病患者的心肌中表达增加。MLK3 通过激活抗肥厚性JNK信号，抑制压力负荷诱导的小鼠心肌肥大、心功能下降和心脏重塑，从而发挥保护作用［3］。血管内膜新生是血管介入术后再狭窄形成的重要机制，而MLK3通过抑制RhoA 的活化抑制血管内膜新生［5］，为血管介入术后再狭窄提供新的干预策略。

血管平滑肌细胞作为血管壁中层主要的细胞类型，其功能及数量对于维持动脉外周阻力、血压调节、血流的分布和动脉的修复至关重要［10］。成熟、分化的血管平滑肌细胞表达平滑肌细胞特异性标志物，包括MYH11、TAGLN（又叫SM22α）及ACTA2（actin alpha 2）［11］，并构成收缩表型。成熟的血管平滑肌细胞几乎不增殖并保持较低的合成活性。病理因素作用下，如高脂、炎症、血管损伤及持续机械张力作用等［12-13］，血管平滑肌细胞表现出显著的功能可塑性，发生表型转化，即由收缩表型转换为合成和增殖表型，表现为血管平滑肌细胞收缩标志物表达降低，增殖、迁移和合成细胞外基质等能力增强［14］。血管平滑肌细胞表型转化是多种血管疾病，包括动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄和主动脉瘤等共同的细胞病理基础［12，15-17］。多种信号通路包括MAPK等参与调控血管平滑肌细胞表型转化。探讨不同病理状态下VSMC 表型转化的分子机制有助于提高对疾病发生、发展及转归的认识。本研究发现平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠的血管平滑肌细胞收缩标志物Myh11表达下降，提示MLK3参与维持血管平滑肌收缩功能及血管稳态。后续的研究将重点探讨MLK3 维持血管稳态及在不同血管疾病中的作用与机制。

由于MLK3 广泛表达于多种组织细胞，并且MLK3调控的生物学过程具有一定的组织特异性，为更准确地研究MLK3 在血管平滑肌细胞中的功能，我们采用基于Cre/loxP 重组酶的条件性基因敲除策略，构建了平滑肌特异性MLK3基因敲除小鼠。Cre/loxP 重组酶系统可实现位点特异性的基因重组，是构建条件性基因敲除鼠的经典方法。本研究中，我们首先通过ES 打靶技术在小鼠MLK3基因的4～8 号外显子两端插入loxP 位点，获得了MLK3-loxP 小鼠，进而与平滑肌细胞特异性启动子Tagln 介导表达Cre重组酶的小鼠杂交。Tagln 启动子特异性介导平滑肌细胞表达Cre 重组酶，表达的Cre 重组酶识别MLK3基因的4～8 号外显子两端插入的loxP 位点并切除中间的DNA 序列，从而实现了平滑肌特异性敲除MLK3基因。利用Tagln启动子介导平滑肌细胞特异表达Cre 酶构建平滑肌特异敲除鼠模型已在多篇文章中报道［18-20］，证实了该启动子的特异性及有效性。为了在蛋白水平进一步证实敲除小鼠构建成功，我们用免疫荧光染色检测了血管组织中MLK3蛋白的表达，发现野生型小鼠的MLK3 在血管内皮细胞及中层平滑肌细胞均有表达，而平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠的内皮细胞有MLK3 表达而中层平滑肌细胞检测不到MLK3 的表达，证实平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠构建成功。进而，我们评价了该品系小鼠的基础表型，发现该小鼠的血压、血脂等指标没有变化，但血管平滑肌收缩标志物Myh11的表达降低，表明MLK3基因缺失可能影响了血管平滑肌细胞的收缩功能。既往研究发现，MLK3基因全身敲除鼠的基础血压升高［3-4］，但我们在平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠中未观察到基础血压的变化，提示MLK3 对血压的调控作用可能不依赖于其在平滑肌细胞中的功能。众所周知，血管壁的主要组成细胞内皮细胞及平滑肌细胞均参与血压维持。我们的免疫荧光结果表明，MLK3在血管内皮细胞也有高表达，基于上述结果，我们考虑血管内皮细胞中的MLK3 在维持血压中发挥重要作用，具体的作用及机制还需深入探讨。

综上所述，平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠构建成功。利用该动物模型可重点探讨血管平滑肌细胞中MLK3 维持血管稳态及在不同血管疾病中的作用与机制。