血管紧张素II促进心脏成纤维细胞转分化的实验条件优化*

冯 姗， 徐文丽， 吴济民， 王 蕊， 赵明明， 曹 宁， 陈显达，王帅星， 张 咪， 谷慧君， 张幼怡， 肖 晗△（北京大学第三医院心内科血管医学研究所，国家卫生健康委心血管分子生物学与调节肽重点实验室，分子心血管学教育部重点实验室，心血管受体研究北京市重点实验室，北京 009；石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 83000）

在病理条件下，心肌间质出现胶原过度沉积，引起心脏纤维化。心脏纤维化是多种心血管疾病的共同特征，并最终导致心力衰竭。心脏中成纤维细胞（cardiac fibroblast，CFs）向肌成纤维细胞转分化是心脏纤维化的重要病理过程［1］，已成为治疗心血管疾病的关键环节。但是筛选抑制CFs 转分化药物的实验条件尚未经系统地评估和优化，是影响实验稳定性和可重复性的关键因素。在转分化后，肌成纤维细胞高表达特征性的α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），同时合成和分泌细胞外基质的能力增强［2-4］，从而促进心脏纤维化［5-7］。血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）是促进CFs 转分化为肌成纤维细胞的重要因素［8］，因此广泛应用于构建体外诱导CFs 转分化的细胞模型。目前心脏CFs 转分化的相关研究选择的细胞代数有第1 代（passage 1，P1）、P2、P3 等，选择的Ang II 刺激时程有24 和48 h等，细胞培养液血清浓度有0%、1%、10% 等［9-13］。本研究拟评估和比较Ang II 引起CFs 转分化的实验条件，为实验研究体系的规范化提供数据支持。

材料和方法

1 动物

新生（1～2日龄）和8周龄SPF 级雄性C57BL/6小鼠，体质量22～24 g，均购自北京大学医学部实验动物中心，许可证号SCXK（京）2021-0006，用于分离成年小鼠（4 只/10 cm 皿）和新生小鼠（40 只/10 cm 皿）CFs。动物饲养和使用均完全遵照北京大学医学部实验相关伦理标准。本研究已获得北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准，批准号为LA2018112。

2 主要试剂

Ang II 购自Sigma-Aldrich；胶原酶Ⅱ和DMEM 培养液购自Gibco；逆转录试剂盒购自Promega；Trizol、Hoechest 33342 和Alexa Fluor 488 偶联的荧光Ⅱ抗购自Invitrogen；抗α-SMA、I 型胶原（collagen type I，Col I）和纤连蛋白（fibronectin，FN）抗体购自Abcam；抗GAPDH 抗体购自Cell Signaling Technology；山羊抗兔IgG（H+L）抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Neonatal Heart Dissociation Kit购自Miltenyi Biotec。

3 主要方法

3.1 成年小鼠CFs 的分离与培养取8 周龄雄性C57BL/6小鼠，断颈后用乙醇消毒，剪开胸腔，取出心脏，修剪去除心耳和主动脉，置于预冷的PBS 中。将心脏剪碎至1 mm×1 mm×1 mm 的糜状，加入5 mL 的0.1% 胶原酶Ⅱ并置于转速为120 r/min 的恒温磁力搅拌器中，37 ℃恒温消化8 min。小心吸走上清，加入胶原酶，重复8～10 次上述过程，直至心脏消化完全。从第2 次消化开始，取上清加入等体积完全培养液，混合均匀。细胞悬液以室温转速200×g离心5 min，用完全培养液将细胞重悬，种于细胞培养皿中，置于37 ℃、5% CO2条件下培养。24 h 后更换培养液继续培养，此时贴壁的CFs 为原代细胞。采用免疫荧光法检测波形蛋白（vimentin）以鉴定CFs。

3.2 新生小鼠CFs 的分离与培养采用Neonatal Heart Dissociation Kit 进行分离。步骤如下：取40 只1～2 d 小鼠心脏，剪掉心脏上的血管组织，在预冷的平衡盐溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS）中冲洗2 遍，用剪刀把心脏组织剪碎并放入含有酶液的组织解离管中，利用Gentle MACS Octo Dissociator仪器消化心脏；消化结束后立即用完全培养液终止消化，70 μm 滤网过滤，200×g离心5 min，弃上清，使用红细胞裂解液去除红细胞，200×g离心5 min。用完全培养液重悬细胞沉淀，种于10 cm 细胞培养皿中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h，进行差速贴壁，去除未贴壁细胞，已贴壁为原代的CFs。用免疫荧光法检测vimentin对CFs进行鉴定。

3.3 细胞传代成年小鼠和新生小鼠CFs 生长至汇合度达90% 时，用1 mL 2.5 g/L 的胰蛋白酶37 ℃消化1 min 至细胞变圆，弃酶液，加入3 mL 完全培养液终止消化。细胞计数后，调整细胞数至1.6×106接种于10 cm细胞培养皿中继续培养。

3.4 实验分组CFs 传代至不同细胞代数（P1～P4），用完全培养液培养过夜后，更换为含不同浓度（0%、2% 和5%）胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培养液，正常培养或加入终浓度为10−6mol/L的Ang II继续培养，分别记为对照（control，Ctrl）组和Ang II组，24或48 h后收集样品进行检测。

3.5 Western blot提取各组细胞样品，使用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）测定样品中蛋白浓度，取相同质量的蛋白样品进行SDS-PAGE，转至硝酸纤维素膜。用TBST 缓冲液配制的5% 脱脂牛奶室温封闭1 h 后，分别加入Ⅰ抗［α-SMA（1∶20 000）、Col I（1∶1 000）、FN（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）］4 ℃孵育过夜。TBST 漂洗3 次，每次10 min，加入山羊抗兔的Ⅱ抗（稀释比例分别为1∶40 000、1∶2 000、1∶2 000和1∶20 000）室温孵育1 h。TBST 漂洗3 次，每次10 min。使用GeneSys ECL 化学发光法系统成像。用ImageJ 图像分析软件测量灰度值，采用目的蛋白/GAPDH灰度值比值来计算蛋白的表达水平。

3.6 固定细胞免疫荧光技术弃掉培养液用PBS洗涤后加入4% 多聚甲醛室温固定30 min，PBS 洗3次，每次5 min。用0.1% 的TritonX-100 室温破膜10 min，再用PBS洗3次，每次5 min。用1% 牛血清白蛋白室温封闭30 min 后加PBS 稀释的Ⅰ抗（1∶100）4 ℃孵育过夜。用PBS洗3次，每次5 min后，加入PBS稀释的Alexa Fluor 488偶联的荧光Ⅱ抗（1∶200）室温避光孵育1 h。PBS 洗3 次，每次5 min，Hoechst 33342染细胞核6 min。利用Array Scan 高内涵系统采集各通道荧光，并分析荧光强度。

3.7 qPCR用Trizol 试剂提取细胞中的RNA，采用Promega 试剂盒逆转录后使用Bio-Rad CFX96 Touch进行qPCR（1 μg RNA）检测。以GAPDH 为内参照，通过2−ΔΔCt法比较目的基因的表达差异。引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，序列见表1。

表1 qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for qPCR

4 统计学处理

采用Prism 8 软件进行统计学分析。数据以均数±标准误（mean±SEM）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或Kruskal-Wallis检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 成年小鼠CFs不同代数比较，P1成年小鼠CFs在Ang II刺激后转分化标志物表达显著增加

成年小鼠CFs传代的处理流程及鉴定如图1A、B所示。细胞免疫荧光结果显示，仅P1 成年小鼠CFs接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 的平均荧光强度较对照组显著增强（P<0.05）；处于P2～P4 的CFs 中α-SMA、Col I 和FN 平均荧光强度与对照组相比均无显著变化（P>0.05），见图1C。qPCR和Western blot 结果同样显示，仅P1 CFs 接受Ang II刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 表达水平显著上升（P<0.05），见图1D、E。且随着代数增加，基础状态下，P4 CFs中α-SMA 和Col I平均荧光强度（图1C）和表达水平（图1D）较P1 CFs显著上升。

2 新生小鼠CFs不同代数比较，P1新生小鼠CFs在Ang II刺激后，转分化标志物表达显著增加

新生小鼠CFs传代的处理流程及鉴定如图2A、B所示。与成年小鼠类似，细胞免疫荧光结果显示，仅P1 新生小鼠CFs 接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 的平均荧光强度较对照组显著增强（P<0.05）；处于P2～P4 的CFs 中α-SMA、Col I 和FN 平均荧光强度与对照组相比均无显著变化（P>0.05），见图2C。qPCR 和Western blot 结果也显示，仅P1 CFs接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I 和FN 表达水平显著上升（P<0.05），见图2D、E。且随着代数增加，基础状态下，P4 CFs 中α-SMA、Col I和FN 表达水平较P1 CFs显著上升，见图2D。

3 Ang II 刺激成年小鼠CFs 不同时程比较，Ang II分别刺激24和48 h均可引起成年小鼠CFs转分化

成年小鼠CFs细胞的处理如图3A所示。细胞免疫荧光结果显示，Ang II 分别处理24 和48 h 后，P1 CFs 中α-SMA、Col I 和FN 的平均荧光强度与对照组相比 均显 著增 强（P<0.05），见 图3B。 qPCR 和Western blot 结果显示，P1 CFs 给予Ang II 刺激24 和48 h，细胞中α-SMA、Col I 和FN 的mRNA 和蛋白表达水平与对照组相比均显著升高（P<0.05），见图3C、D。

Figure 1.Transdifferentiation of adult mouse cardiac fibroblasts in different passages（P1 to P4）induced by Ang II for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：vimentin in adult mouse cardiac fibroblasts observed by immunofluorescence staining（scale bar=20 μm）；C：immunofluorescence staining（scale bar=25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；D：the mRNA expression of α-SMA, Col I and FN detected by qPCR；E：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs Ctrl（P1）group.图1 成年小鼠成纤维细胞不同代数（P1～P4）给予Ang II刺激48 h后的转分化情况

Figure 2.Transdifferentiation of neonatal mouse cardiac fibroblasts in different passages（P1 to P4）induced by Ang II for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：vimentin in neonatal mouse cardiac fibroblasts observed by immunofluorescence staining（scale bar=20 μm）；C：immunofluorescence staining（scale bar =25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；D：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；E：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（P1）group.图2 新生小鼠成纤维细胞不同代数（P1～P4）给予Ang II刺激48 h后的转分化情况

4 Ang II 刺激新生小鼠CFs 不同时程比较，Ang II刺激48 h可引起P1新生小鼠CFs转分化

新生小鼠CFs细胞的处理如图4A所示。细胞免疫荧光结果显示，Ang II处理24和48 h后，P1新生小鼠CFs中α-SMA 和Col I的平均荧光强度与对照组相比均显著增强（P<0.05），但FN的平均荧光强度仅在刺激48 h 后显著增强，见图4B。qPCR 和Western blot 结果均显示，Ang II 处理24 和48 h 后，P1 CFs 中α-SMA 的mRNA 和蛋白表达水平与对照组相比均显著上升（P<0.01），但Col I 和FN 的表达水平仅在刺激48 h后显著升高，见图4C、D。

5 比较不同血清浓度培养液培养成年小鼠CFs，在含0% 和2% FBS 的培养液培养时，CFs 受Ang II 刺激后转分化更显著

成年小鼠CFs细胞的处理如图5A所示。细胞免疫荧光结果显示，在含0% 和2% FBS 的培养液中培养时，P1 CFs接受Ang II刺激48 h后，其α-SMA、Col I和FN的平均荧光强度与对照组相比均显著增强（P<0.05），见图5B。qPCR 和Western blot 结果显示，这些标志物的mRNA 和蛋白水平变化与免疫荧光的结果一致，见图5C、D。值得注意的是，在无Ang II刺激情况下，5% FBS 培养液与0% FBS 培养液相比，CFs中α-SMA、Col I 和FN 的mRNA 表达水平均显著升高，见图5C。

6 比较不同血清浓度培养液培养新生小鼠CFs，在含0% 和2% FBS 的培养液培养时，CFs 受Ang II 刺激后转分化更显著

新生小鼠CFs细胞的处理如图6A所示。细胞免疫荧光结果显示，分别在含0% 和2% FBS 的培养液中培养时，P1 新生小鼠CFs 接受Ang II 刺激48 h 后，其α-SMA、Col I和FN 的平均荧光强度与对照组相比显著增强（P<0.05）；在含5% FBS 的培养液中培养时，CFs中α-SMA、Col I和FN的平均荧光强度与对照组相比无显著差异，见图6B。qPCR 和Western blot结果呈现了一致的变化趋势，见图6C、D。同样在无Ang II刺激情况下，5% FBS 培养液与0% FBS 培养液相比，CFs中α-SMA、Col I和FN的mRNA表达水平均显著升高，见图6C。

讨 论

本研究对成年小鼠和新生小鼠CFs 转分化的实验条件进行了评估，结果表明成年小鼠CFs 最适宜的实验条件为：P1，含0%或2% FBS的培养液，Ang II刺激24 或48 h；新生小鼠CFs 最适宜的实验条件为：P1，含0%或2% FBS的培养液，Ang II刺激48 h。

CFs具有强大的分化潜能，增殖能力强且代谢旺盛，可体外培养、多次传代［14-17］。有研究提出，当在培养皿中培养时，与P0 的大鼠CFs 相比，P1～P3 细胞的大小显著增加，细胞中的肌成纤维细胞标志物α-SMA、vimentin、前列腺素和Col I表达水平显著升高，大鼠CFs 随着传代数的增加，肌成纤维细胞的含量增多［18-19］。本研究利用Ang II 在不同细胞代数情况下刺激成年小鼠和新生小鼠的CFs，结果显示P1 成年小鼠和新生小鼠CFs 在接受Ang II 刺激48 h 后均可出现显著转分化，随着细胞传代次数的增加，成年小鼠和新生小鼠CFs 自身也可以出现转分化，导致Ang II无法进一步诱导转分化。

据报道，用Ang II 刺激成年小鼠和新生小鼠CFs 24 h 可显著上调细胞内肌成纤维细胞的标志物α-SMA 的表达，刺激至48 h 时，表达水平持续上升［20］。本研究使用Ang II 刺激P1 成年小鼠CFs 24 或48 h，刺激P1 新生小鼠CFs 48 h，均可出现显著的转分化。在Ang II 刺激P1 新生小鼠CFs 24 h 时，仅转分化标志物α-SMA 的表达显著升高，细胞外基质蛋白Col I和FN 的表达无显著差异。结合之前的研究，我们推断在Ang II 刺激P1 新生小鼠CFs 24 h 时，可能由于刺激时间较短，不足以诱导细胞发生显著的转分化导致构建模型不稳定。所以，使用Ang II 构建成年小鼠细胞模型时，刺激时程24 和48 h 均适用；而构建新生小鼠细胞模型时，选择48 h更合适。

FBS 是一种含有细胞生长和维持所需营养物质的复合物［21］。研究显示，FBS 以剂量依赖的方式激活小鼠CFs中TGF-β1信号通路，促进CFs转分化［22］。本研究对在含0% FBS、2% FBS 和5% FBS 的培养液中培养的成年小鼠和新生小鼠CFs 给予Ang II 刺激48 h 后，观察成年小鼠和新生小鼠CFs 仅在含0% 和2% FBS 的培养液中培养时，细胞发生显著的转分化。我们的结果还显示，在无Ang II 刺激情况下，5% FBS 培养液与0% FBS 培养液相比，CFs 中α-SMA、Col I 和FN 的mRNA 表达水平均显著升高。因此，我们推断导致上述差异的原因可能是在高血清状态下，血清会促进CFs转分化导致Ang II无法进一步诱导细胞的转分化，过高的血清浓度均会影响成年小鼠和新生小鼠CFs的转分化。

Figure 3.Transdifferentiation of adult mouse cardiac fibroblasts after Ang II stimulation for 24 and 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：immunofluorescence staining（scale bar =25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；C：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；D：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（24 h）group；#P<0.05，##P<0.01 vs Ctrl（48 h）group.图3 成年小鼠成纤维细胞在Ang II刺激24和48 h后的转分化情况

Figure 5.Transdifferentiation of adult mouse cardiac fibroblasts in media containing different concentrations（0%，2% and 5%）of fe‑tal bovine serum（FBS）after Ang II stimulation for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：immunofluores‑cence staining（scale bar=25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；C：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；D：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（0% FBS）group；*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（2% FBS）group.图5 成年小鼠成纤维细胞在不同血清浓度（0%、2%和5%）培养液培养时，给予Ang II刺激48 h后的转分化情况

Figure 6.Transdifferentiation of neonatal mouse cardiac fibroblasts in media containing different concentrations（0%，2% and 5%）of fetal bovine serum（FBS）after Ang II stimulation for 48 h.A：the schematic diagram of cell culture；B：immunofluores‑cence staining（scale bar=25 μm）and average fluorescence intensity of α-SMA，Col I and FN；C：the mRNA expression of α-SMA，Col I and FN detected by qPCR；D：the protein expression of α-SMA，Col I and FN detected by Western blot.Mean±SEM. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs Ctrl（0% FBS）group；#P<0.05，##P<0.01 vs Ctrl（2% FBS）group.图6 新生小鼠成纤维细胞在不同血清浓度（0%、2%和5%）培养液培养时，给予Ang II刺激48 h后的转分化情况

综上所述，本研究进一步优化Ang II 诱导的CFs转分化细胞模型的实验条件，主要通过对成年小鼠和新生小鼠CFs 的不同代数、不同处理时程和不同血清浓度培养液培养进行评估，显示在含0% 或2%FBS 的培养液中用Ang II 刺激P1 成年小鼠24 或48 h均可以出现显著的转分化，在含0% 或2% FBS 的培养液中用Ang II刺激P1新生小鼠48 h可以出现显著的转分化。以上分别是CFs转分化成年小鼠/新生小鼠细胞模型的较优的实验条件。本研究将为后续对于心脏纤维化的相关研究奠定实验基础。