干血点技术在抗菌药物治疗药物监测中的研究

陈 焰， 张 菁,*， 王 雨， 黄晓岚， 刘笑芬

干血点（dried blood spot）技术是指通过微量采集末端毛细血管血（10～100 μL），经特制卡片吸收形成干燥血点进行分析的技术，是生物分析领域中一种有效可行的采血技术。1963年Guthrie和Susi首次报道了在干纸片上收集微量血样用于新生儿苯丙酮尿症的筛查[1]，之后干血点技术便迅速发展，在治疗药物监测（TDM）、临床前研究、辅助疾病诊断等诸多领域广泛应用。与传统的静脉采血方式相比，干血点技术凭借其采血量少、侵入性低、可操作性强、运输便捷等显著优势[2]，倍受关注和研究。随着高效液相色谱、质谱等精密分析技术，以及容量吸收微采样装置（VAMS）、干血点样本全自动在线提取设备、干血点全点分析技术等新装置和技术的开发[3]，干血点技术与生物分析的结合越来越显示了其临床推广应用的前景。

TDM是实现个体化用药、精准医疗的重要手段。目前，我国开展TDM的药物种类繁多，包括精神类药物、抗菌药物、抗肿瘤药物、免疫抑制剂、心血管系统药物等，约占临床常用药物的10%[4]。对一些治疗指数低、治疗窗窄、毒性大、个体差异大的药物需进行TDM，如万古霉素、多黏菌素、阿米卡星等[5]，其重要性和必要性被广大医师和药学研究者所认识[6]。

干血点技术作为一种便捷可行的技术，在检测条件有限、患者依从性差、储存运输不便情况下能够有效代替静脉采血进行TDM。然而，干血点技术在我国抗菌药物乃至整个TDM领域的研究和应用较少。本文对干血点技术实施中所涉及的问题以及在抗菌药物TDM中的应用进行综述，以促进该项技术在TDM中应用。

1 干血点技术

1.1 样本的采集

微量采血作为干血点技术优势之一，规范的血样尤为重要，严格意义上的干血点是指全血斑点，并不包括干血浆斑点（dried plasma spot）及干血清斑点（dried serum spot），但鉴于均来源于全血，对此一并讨论。干血点样本的采集、运输和储存等过程，是结果差异的主要来源，是保证分析结果的准确性和成功转化临床的基础[7]。

首先，选择合适的纸片收集微量血样是保证最终分析准确的前提，纸片的材质、孔隙大小和厚度等性质会影响微量血样在纸片上的吸收特性和均匀性，对最终结果产生影响[2]。Whatman 903、Ahlstrom 226纸是FDA批准的两类医疗耗材[8]，由100%纯棉绒制造，无任何湿强剂添加，应用于众多领域。Whatman FTA Elute卡片与液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）联用，广泛应用于临床研究中药物小分子及其代谢物的定量分析[2]。对在抗菌药物TDM中应用的干血点纸片进行筛选验证和质量控制，将是促进其更广泛应用的有效手段。

传统的干血点采用针刺足后跟、手指或脚趾收集血样，其中血容量不足、红细胞压积效应、全血点中蛋白结合和基质效应等问题对药物浓度测定有影响。红细胞压积会影响全血在纸片的扩散均一性，是最受关注的影响因素[9]。避免或减少红细胞压积影响的技术和方法包括全点分析法、VAMS、容积式吸收纸盘（VAPD）、限定体积毛细管吸收的Capitainer-B设备、可折叠微流控HemaXis DB装置、采用干血浆斑点替代全血、红细胞压积校正方法等[10]。

近年来，一些更高效便捷、新颖的设备用于干血点样本采集，如新型的自动化和可穿戴的Fluispotter设备，可实现高精度的连续自动采样[11]；热诱导相分离（TIPS）和非溶剂诱导相分离（NIPS）相结合的平板型PAN膜，可有效分离100%血细胞制得干血浆点[12]，这些新采样技术均能有效改善干血点应用所面临的问题，从而推动其广泛应用，但在实际应用时还需要进行充分的验证以及考虑成本效益等因素。

1.2 干血点样本保存、运输

对于干血点样品的干燥，一般情况下，建议纸片在室温（20～25℃）下放置2～3 h，或可采用氮气流吹干，具体时间需要随纸片性质和采血量而调整[2]。在应用中，有必要对干燥时间进行考察，以确定最佳干燥时间，保证样品的均一性。干燥的纸片样本，无论在室温、低温还是复杂的运输条件下，其稳定性优于血液样本，但稳定性的时间还要考察及验证。干血点技术为TDM样本的保存运输提供了保障，尤其对在液体基质中不稳定的药物如黏菌素甲磺酸盐具有重要优势[13]。此外，干燥处理后的样本可有效降低其生物危害性，只需简单的自封袋包装便能便捷运输。

1.3 样本前处理和分析测定

干血点样本的打孔和提取是前处理过程的重要部分，从纸片上截取合适大小的样本和将待测物从纸片中充分提取出来可有效提高分析的准确性。一般认为小的点样体积和大的打孔面积会带来较好的精密度[14]，穿孔样本的提取需要根据分析物的极性、稳定性来选择合适的提取溶剂（甲醇、乙腈或水混合物），选择适当的震摇或超声可提高提取率[2]。也有研究在预处理前添加适宜的溶剂进行预浸渍，以提高提取效率[15]。LC-MS/MS是生物样品中药物定量测定的首选方法，其高灵敏度为干血点中微量样本的分析提供了可靠的技术支持[16]。虽然高效液相色谱、气相色谱串联质谱、免疫分析法等也有应用，但由于灵敏度、特异度或耗时问题，应用有限[2]。

近年来，在线提取和预处理方法已被开发应用到干血点样本的前处理过程，免除了繁琐的打孔和预处理步骤，如DBS-MS 500自动进样器（CAMAG，瑞士）连接CTC PAL （Zwingen，瑞士）系统，可实现自动提取和预处理，与LC-MS/MS联用可实现全自动检测[17]；Gerstel （Mülheim an der Ruhr，德国）自动干血点样本制备系统，是集提取、进样、多位置蒸发站、高压分配泵等模块于一体的高效在线样本处理系统[18]。

2 干血点在抗菌药物TDM中的应用

2.1 β内酰胺类

β内酰胺类抗生素包括青霉素类、头孢菌素类以及其他β内酰胺类，其抗菌谱广、毒性低、治疗窗宽，在临床广泛应用，然而药物不良反应也不容忽视，尤其在老年人、儿童以及重症患者中应给予足够重视，TDM是优化治疗、减少不良反应发生的重要措施[6]。干血点技术可有效改善分析物的稳定性，例如进行常规TDM时，一般美罗培南从采血到分析超过4 h就需要干冰存储，而干血点样本中的稳定性数据显示美罗培南在－20℃和6℃下至少7 d稳定、23℃时48 h稳定，显示出了优势[19]。干血点样本中厄他培南在不同温度下运输时至少1个月稳定[20]。此外，在已报道采用LC-MS/MS测定干血点中β内酰胺类抗生素还有头孢曲松[21]、哌拉西林-他唑巴坦[22]等，同样显示比常规TDM样本具有更好的稳定性。

2.2 氨基糖苷类和多肽类

氨基糖苷类和多肽类药物TDM在实际应用中相对最为广泛，尤其在肾功能不全患者中已被列为常规检测[5]，在治疗过程中对氨基糖苷类药物、万古霉素和多黏菌素等多肽类抗菌药物进行TDM在国内外许多指南中均有提及[23]。Da等[24]采用Whatman-903纸片收集25 μL血浆样本，采用超高效液相色谱（UPLC） -MS/MS同时测定干血浆斑点中的阿米卡星和肌酐浓度，实现了血药浓度和肾功能的同时监测，该方法用于药动学模拟，并提出剂量建议，为有限资源下获得阿米卡星个体化剂量提供了极大的帮助。Scribel等[16]对干血点中万古霉素和肌酐同时进行测定，同样采用Whatman-903纸片，但选用全血样本，结果显示患者血浆与干血点中万古霉素浓度存在差异，即使经过红细胞压积校正，浓度差异仍然很大，不能用于监测万古霉素的血药浓度，而对肌酐则能获得满意的结果，因此基于干血点技术的万古霉素血药浓度检测方法还有待研究。

Tsai等[13]使用LC-MS/MS测定干血点中黏菌素的主要成分（黏菌素A和黏菌素B），使用乙腈和0.15%甲酸水溶液（1∶1）作为提取液，线性分别为0.13～10.4 mg/L、 0.27～21.6 mg/L，通过对易水解的前药黏菌素甲磺酸盐（CMS）在干血点中的稳定性考察，显示室温放置48 h后CMS水解少于4%，可有效降低因水解所产生的偏差，成为黏菌素定量的重要替代方法。Cangemi等[25]采用干血浆斑点样本以及干燥样点设备（DSSD）来定量黏菌素，避免了红细胞压积影响，为临床应用提供了有效的支持。

2.4 抗结核类药物

结核病是全球主要的公共卫生问题之一，抗结核药物的TDM对结核病的治疗非常重要，然而有限的PK/PD数据及不发达地区的监测条件不足，使得抗结核药在治疗中受到限制，尤其是儿童患者[28]。Martial等[28]对儿童患者的一线抗结核药物（利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇）的干血点和常规静脉采样的测定结果进行分析和对比，利福平和吡嗪酰胺在两种方法中具有良好的一致性，而乙胺丁醇显示有较大差异。Lee等[29]采用LC-MS/MS对比分析静脉和毛细血管干血点以及血浆中的异烟肼浓度，显示三者之间存在偏差，但成比例，相关性良好，鉴于缺乏对红细胞压积影响的考察和足够的样本数量验证，这项研究依然存在着局限性。

2.5 多种抗菌药物同时检测

开发多种抗菌药物同时检测的方法，在TDM中具有非常大的应用价值， Barco等[30]开发了采用VAMS设备联用LC-MS/MS同时测定哌拉西林-他唑巴坦、美罗培南、利奈唑胺和头孢他啶4种药物的方法，并将这种新的采样设备与传统的干血点技术所检测的结果进行对比，VAMS-LC-MS/MS方法对4种药物均有良好的选择性、精密度和重现性，可以在不受红细胞压积影响的情况下进行准确的定量，现已被应用于儿科患者的TDM。Ferrone等[31]建立了HPLC-PDA（二极管阵列检测器）测定毛细血管干血点样本和静脉干血点样本中利奈唑胺和环丙沙星浓度的方法，选用非纤维素Bond Elut DMS（干基质点）样品制备卡，可有效减少红细胞压积带来的分析误差，结果显示两者相关性良好，准确度、精密度等验证结果良好，可作为常规监测的重要工具。

2.6 其他抗菌药物

达托霉素对革兰阳性菌有快速杀菌作用，具有浓度依赖性，对其进行TDM有助于提高疗效、改善预后， Baietto等[32]采用UPLC-PDA检测方法定量血浆和干血浆斑点中达托霉素，分别用乙腈和乙酸乙酯∶乙酸∶丙酮∶水（50∶20∶20∶10）提取，两种方法在0.781～200 mg/L校正范围内呈线性相关，药物浓度也具有显著的相关性（P＜0.001，r2=0.919），方法验证提示可适用于TDM。

磷霉素可有效治疗由多药耐药细菌引起的严重感染，然而在危重症患者中PK研究和TDM的缺乏给治疗带来了困难， Parker等[33]利用LCMS/MS对干血点中磷霉素进行定量，并且采用了VAMS设备进行样本的收集，结果显示准确度和精密度均在±15%偏差内，线性为5～2 000 mg/L，但稳定性和回收率的考察结果显示其应用存在不足。

另外氟喹诺酮类药物莫西沙星，在口服治疗耐多药结核病中具有良好前景应用。Vu 等[34]开发一种LC-MS/MS测定干血点中莫西沙星的方法，观察红细胞压积和血容量的影响，并对静脉和指尖干血点中的药物浓度进行了对比，经过充分验证和对红细胞压积校正，可适用于TDM。

3 总结与展望

通过对近年来关于干血点及其在抗菌药物TDM中的应用相关文献的回顾发现，干血点技术的开展，以及新技术、仪器、方法相继出现，使该项技术也成功用于多种抗菌药物的TDM。其微量采血、优良的适应性、便捷高效的样本储存运输等绝对优势，使得干血点技术在有限的资源环境下表现出了巨大的应用潜力。尽管我国抗菌药物TDM中干血点技术的应用有限，但不断深入开展和研究，将会为个体化用药拓展新的发展方向。