氟乐灵抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立

黄惠威，刘凤银，曾思敏，曾羲，钱振杰，施迪燊，聂玉丹，江海超，袁学文，穆洪涛*

（1.广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东广州 510303）（2.广州市食品检验所，广东广州 511400）

氟乐灵属于二硝基苯胺类药物[1]，广泛应用于防除单子叶杂草[2]，也可以抗有丝分裂阻止染色体加倍获得单倍体植株[3,4]，具有价格低廉、药效明显等特点[5,6]。然而氟乐灵会残留在食品或环境中，对水生生物和环境造成危害，也会极大影响人体健康[7-9]，例如胎儿发育不正常、内分泌功能失调和致癌等[10,11]。

氟乐灵的广泛应用造成大量氟乐灵农药残留量超标现象[12,13]，因此许多国家和组织对氟乐灵农药制定了严格的残留限量[14-16]。例如，欧盟规定玉米、棉籽和花生仁中氟乐灵农药残留限量为10 μg/kg[6]，日本规定油为15 μg/kg，澳大利亚规定油料为50 μg/kg[7]，中国规定大豆、花生、豆油、花生油、玉米、棉籽、花生仁为 50 μg/kg[7,16]。氟乐灵农药在土壤中留存持久，半衰期约为 3～12个月[17]，氟乐灵的广泛应用和长期存在，对水生生物具有高毒[18]，也会影响农作物的出苗率和生长[19]。2010年日本屡次检出中国出口的水产品梭子蟹和鳗鱼中的氟乐灵超标[20]，因此日本要求加强对中国梭子蟹和鳗鱼中的氟乐灵农药的监控检查，造成中国水产品梭子蟹和鳗鱼的出口难度加大。2019年《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763-2019）规定食用油中氟乐灵为必检农药残留项目，规定最大残留限量为50 μg/kg[21]，因此建立农（水）产品中高通量快速检测氟乐灵残留的方法很有必要。

目前，对于大豆、花生、豆油、花生油中的氟乐灵残留量的检测，我国规定气相色谱法作为标准检测方法[16]。近几年国内外主要采用色谱法[22,23]、电化学方法[24-26]、荧光法[27,28]检测氟乐灵残留，虽然这些方法可靠准确，但耗时较长且专业人员要求较高，检测成本较高，不适用高通量现场快速筛查，而酶联免疫分析方法具有高通量、灵敏度较高、特异性较好、耗时较短、成本较低、操作简单且适合基层广泛推广应用等优点，是当前快速检测的主要方法[29-31]，但现阶段国内缺乏快速检测氟乐灵农药的酶联免疫分析方法。2000年Hegedűs等[32]制备了氟乐灵多克隆抗体，采用酶联免疫分析方法对地表水样和蔬菜汁进行氟乐灵残留检测；2008年Krämer等[33]采用酶联免疫分析方法对水和土壤中的氟乐灵残留进行了检测。以上研究主要针对水样、土壤、蔬菜汁等进行氟乐灵残留检测，而本研究开发了针对大豆、大豆油、对虾等农（水）产品中的氟乐灵残留快速检测方法，为满足现阶段国内对氟乐灵检测的需求和提高食品安全水平具有重要意义。

本研究设计并合成了一种新型的氟乐灵完全抗原，通过免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体，并对包被原和抗体的稀释倍数、包被温度、抗体和标准品稀释液等条件进行系统优化，进而建立一种检测农（水）产品中氟乐灵农药残留的间接竞争酶联免疫分析方法（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA），该方法具有灵敏度高、特异性好的特点，为进一步开发氟乐灵残留酶联免疫检测试剂盒或试纸条提供理论依据，也为农（水）产品安全提供更有效的保障，从而保障人类的身体健康。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新西兰大白兔广东省医学实验动物中心；氟乐灵、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二环己基碳化二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）、弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FICA）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）广州齐云生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG沈阳万类生物科技有限公司；聚苯乙烯酶标板厦门怡佳美实验器材有限公司；氟乐灵20种结构类似物荷兰specs生物特殊化合物服务有限公司；包被液、磷酸盐缓冲液（PBS）、含吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）、Tris-HCl缓冲液（Tris-HCl）实验室配制；其它化学试剂均为国产分析纯。洗涤液：Na2HPO4·12H2O 16 g，NaCl 40 g，吐温-20 3 mL，用蒸馏水定容到500 mL；封闭液：硼酸3.22 g，四硼酸钠3.26 g，蔗糖30 g，酪蛋白2 g，鱼皮明胶4 g，氨基比林1 g，Proclin 300 0.5 mL；终止液：10%硫酸溶液；TMB显色液：过氧化脲0.03 g，α液45 mL，TMB 0.03 g，DMSO 1.8 mL，β液36 mL，甘油4 mL。

DK-8AD电热恒温水热槽，，上海一恒科学仪器有限公司；XP.5002电子天平，上海越平科学仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；MX-F震荡仪、PHSI-5实验室PH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；RT-3100全自动洗板机，深圳雷杜生命科学股份有限公司；SP-Max2300光吸收型全波长酶标仪，上海闪谱生物科技有限公司；Agilent 7890B气相色谱（配 ECD）、色谱柱（DB-1701，30 m×0.25 mm×0.25 μm），美国安捷伦科技有限公司；料理机（L22-Y86），九阳股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 氟乐灵半抗原的合成与鉴定

氟乐灵半抗原2C合成路线如图1所示。将2-吡咯烷酮（1000 mg，11 mmol）溶于10 mL DMF，加入13.2 mmol氢化钠（60%）和正溴丙烷（1758.9 mg，14.3 mmol），在氮气保护下，70 ℃油浴搅拌过夜。反应液中加入70 mL乙酸乙酯和50 mL饱和氯化铵溶液，进行萃取后合并有机相，用10 g无水硫酸钠干燥20 min。40 ℃旋干（0.09 MPa），获得含酯基的仲胺中间体。将其加入13 mL 4 mol/L NaOH溶液于100 ℃油浴搅拌过夜进行水解得到水解产物后，将 3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯溶解于6 mL四氢呋喃，加入到水解产物中，室温搅拌1 h。然后用30 mL水进行稀释，加1 mol/L盐酸调pH至2～3，沉淀物出现。再用乙酸乙酯萃取两次，沉淀溶解。之后用10 mL饱和食盐水对有机相分别进行洗涤，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，40 ℃旋干，用层析液于硅胶板进行分离，获得产物半抗原2C。半抗原2C分离纯化后，经薄层层析初步鉴定，再通过高分辨质谱（MS）和核磁共振氢谱（NMR）等手段进行精细结构鉴定。

1.2.2 人工完全抗原的制备和鉴定

本研究采用碳二亚胺法偶联合成人工完全抗原，在偶联过程中碳二亚胺能使半抗原的羧基与蛋白质的氨基发生缩合，生成酰胺和酯。免疫原采用了BSA为载体蛋白，包被原则采用了 OVA作为载体蛋白，抗原经过透析纯化后采用紫外吸收光谱进行鉴定。

1.2.2.1 活化半抗原2C

称取22 mg半抗原2C置于10 mL棕色玻璃瓶内，加入1 mL无水DMF和磁子，置于磁力搅拌器上搅拌5 min，溶解完全为α液；称取24.05 mg DCC于1 mL离心管内，加入96 μL无水DMF，振动使其完全溶解为β液；称取13 mg NHS于1 mL离心管内，加入25 μL无水DMF，振动使其完全溶解为γ液。取α液加入β、γ液置于4 ℃下磁力搅拌过夜，后将其转移至1.5 mL离心管，19000 r/min离心10 min，取上清液于新离心管中，为δ液。

1.2.2.2 2C-BSA/OVA的偶联

称取20 mg BSA/OVA置于10 mL棕色玻璃瓶中，加入4 mL PBS缓冲液和磁子于磁力搅拌器上持续搅拌后，向BSA/OVA溶解液中缓慢滴入582.4 μL/512.2 μL的δ液，4 ℃磁力搅拌12 h，8000 r/min离心20 min，取上清液。将上清液透析3 d，每日透析3次，透析结束后保留最后一次透析液进行浓度调整；波长设置为200～800 nm，对2C、2C-BSA、2C-OVA、BSA、OVA进行紫外吸收光谱鉴定；鉴定完成后分装标记好后存于-20 ℃，以备后续试验。

1.2.3 动物免疫与多克隆抗体的制备

将2C-BSA与等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等量乳化，初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫则使用弗氏不完全佐剂，采用乳化器进行乳化直至溶液变成白色乳浊液且滴到水面上30 s内不扩散后进行免疫。选取两只洁净、体重为1.5～2.0 kg新西兰大白兔进行背部皮下4～5点注射，每两周加强注射一次。首次免疫剂量为2 mL/只，后面每次免疫1 mL/只，每次免疫间隔时间为2周。共进行5次加强免疫，最后一次加强免疫后第 7 d从兔子心脏取全血，孵育 30 min，10000 r/min离心10 min，收集上清液并分装储存于-20 ℃。

1.2.4 ic-ELISA基本步骤

包被：用PBS稀释液液稀释包被抗原，37 ℃包被13 h；封闭：洗涤液洗板2次，加入120 μL封闭液，37 ℃封闭3 h；烘干：甩干孔中液体，37 ℃烘干1 h；加样：加入氟乐灵标准品和兔抗溶液50 μL/孔，37 ℃孵育一段时间；加酶标二抗溶液：洗板5次，加入稀释到最佳倍数的酶标二抗溶液100 μL/孔，孵育一定时间；显色：洗板5次，加入TMB显色液100 μL/孔，37 ℃水浴锅反应10 min；终止反应：加入终止液50 μL/孔，用酶标仪在450 nm下测定OD值。

1.2.5 ic-ELISA方法的优化

采用棋盘滴定法确定包被抗原及抗体的最适工作浓度，用包被原稀释液将 1 μg/mL包被原分别按1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000、1:14000、1:16000稀释，用PBST溶液将2.26 μg/mL抗体按 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000稀释，按照ic-ELISA基本步骤操作，确定最佳包被稀释倍数及抗体稀释倍数。

将包被原和抗体稀释至最佳工作浓度后，选取37 ℃和4 ℃两种温度包被13 h，按照1.2.4ic-ELISA基本步骤操作，选择Amax在0.8～1.5之间，Amax/IC50（IC50为半数抑制浓度）最大，IC50最小时的条件为ic-ELISA的最佳工作条件；最适包被温度确定后，选择Tris-HCl、PBS和PBST稀释液稀释抗体和标准品，按照ic-ELISA基本步骤操作，得到抗体稀释液与标准品稀释液不同组合条件下的标准曲线，综合考虑Amax值、IC50值和Amax/IC50值，确定最佳抗体稀释液与标准品稀释液的组合；确定好以上最佳工作条件后，设置20、30、40、50和60 min五个竞争反应时间梯度，按照ic-ELISA基本步骤操作，选择Amax在0.8～1.5之间，灵敏度高的反应时间作为最佳条件；基于以上优化好的工作条件，最后对酶标二抗稀释液进行优化，选择选择Tris-HCl、PBS和PBST三种稀释液稀释酶标二抗，按照ic-ELISA基本步骤操作，综合考虑Amax值、IC50值和Amax/IC50值，确定最优的酶标二抗稀释液。

1.2.6 标准曲线的绘制

在上述优化条件下，梯度稀释标准品溶液浓度（0.000256、0.00128、0.0064、0.032、0.16、0.8、4.0 μg/mL）进行ic-ELISA方法测定，得到不同浓度氟乐灵标准品所对应的OD值。以氟乐灵标准品浓度的对数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，并确定其灵敏度（IC50）和线性范围（IC20～IC80），从而评价所建立方法的灵敏度和线性范围。

1.2.7 交叉反应测定

在最优的工作条件下，本研究选取与氟乐灵结构或功能类似的20种药物FCRL、G-031和IPPL等进行抗特异性测定，通过各种药物的标准曲线分别得到其IC50值。交叉反应率越高，特异性越差，交叉反应率（CR）计算公式如下：

式中：IC50（氟乐灵）为引起 50%抑制的金刚烷胺浓度（ng/mL），IC50（结构类似物）为引起50%抑制的结构类似物浓度（ng/mL）。

1.2.8 样品前处理方法、添加回收实验与仪器确证

1.2.8.1 样品前处理

取鳗鱼、对虾、大豆油、大豆作为检测样品。样品去皮去壳并搅碎，取2.5 g加入10 mL乙腈，震荡15 min，6000 r/min离心3 min。取5 mL上清液到净化管中，涡旋1 min后振摇15 min，6000 r/min离心3 min，取2 mL上清液于15 mL离心管中，45 ℃下水浴氮吹近干，加入1 mL正己烷定容，涡旋过膜装瓶上机。将净化后的溶液用氮吹仪氮吹完全，然后根据所需浓度加入一定量的甲醇和 PBS缓冲溶液超声提取这些溶液30 min。

1.2.8.2 添加回收实验

按照方法1.2.7.1处理样品，在超声提取的溶液中添加一定量的标准工作液，使之含量分别为0.08 μg/g、0.5 μg/g、0.1 μg/g 的加标样品。用建立的ic-ELISA 方法进行测定，每个样品重复3次并计算出回收率和变异系数（变异系数（CV）=标准差/平均数）。

1.2.8.3 仪器方法确证

采用气相色谱法（GC-ECD）（NY/T 761-2008）进行仪器确证。GC-ECD分析条件：DB-1701色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃，进样方式为不分流进样，进样量 1 μL，载气为氮气（99.999%），恒定流量1.0 mL/min，程序升温：初温为60 ℃，保持0.5 min后，以10 ℃/min升至200 ℃，然后以30 ℃/min升至270 ℃，保持5 min。在鳗鱼、对虾、大豆、大豆油的空白样品中添加一定量的标准工作液，使之含量分别为0.08、0.5、0.1 μg/g的加标样品，按照方法1.2.7.1处理样品，采用气相色谱法测定样品的抗体浓度，每个样品设3个重复，计算回收率和精密度。

1.2.9 数据处理

采用Microsoft Excel、origin 8.5对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 半抗原的合成鉴定

半抗原的合成采用2-吡咯烷酮与正溴丙烷70 ℃下油浴搅拌过夜后获得黄色油状物，碱性水解过夜，加入3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯，反应1 h，获得半抗原2C（结构见图1）。将制备的半抗原2C分离纯化，采用薄层分析法进行初步鉴定（Rf=0.8）之后，通过高分辨质谱（MS）和核磁共振氢谱（NMR）进行精细结构鉴定。1H-NMR 图谱中（图 2（a）），δ为 8.00×10-6的s峰是苯环上的两个氢；δ为3.07×10-6～2.98×10-6的m峰归属于与氮相连的亚甲基上的氢；δ为2.94×10-6～2.86×10-6的 m 峰归属于二级碳上的氢；δ为 2.34×10-6的 t峰归属于与羟基邻位的亚甲基上的氢，耦合常数为7.2 Hz；δ为1.89×10-6～1.79×10-6的m峰归属于与羟基间位的亚甲基上的氢；δ为1.55×10-6的dd峰归属于与甲基邻位的亚甲基上的氢，耦合常数为7.5 Hz；δ为0.81×10-6的t峰归属于甲基上的氢，耦合常数为7.4 Hz。电子轰击质谱（EI-MS）图谱中（图 2（b））出现了一组预期的同位素分子离子峰，其高度是 380.1（m/z，M+）。根据其核磁共振氢谱与质谱数据，证明半抗原2C制备成功。

2.2 完全抗原的合成鉴定

完全抗原的合成采用碳二亚胺法，通过紫外分光光度计检测，检测数据通过Origin 8.5作图，结果如图3所示。由图3可知，2C、BSA、OVA在419 nm、280 nm、279 nm处具有特征吸收峰，2C-BSA和2C-OVA分别在279 nm和276 nm处有特征吸收峰，2C-BSA和2C-OVA相对BSA和OVA的最大吸收峰位置均向左发生偏移，因此初步判定完全抗原偶联成功，后期产生的抗体和建立的检测方法也充分证明完全抗原偶联成功。

2.3 ic-ELISA方法的优化

本研究对包被原和抗体稀释倍数、包被温度、抗体和标准品稀释液、竞争时间、酶标二抗稀释液这些工作条件进行优化，IC50值越低，灵敏度越高，综合考虑Amax、IC50和Amax/IC50和曲线拟合度，从而得出最优的条件参数。包被原和抗体稀释倍数对ic-ELISA影响明显，浓度的过高或过低都会影响抗原抗体的结合，从而降低方法灵敏度，影响 Amax和曲线稳定性。包被原和抗体稀释倍数的优化结果如图4a所示，选择OD值为1.0～1.5的4对稀释倍数组合（包被原稀释倍数/抗体稀释倍数：24000/1000、10000/3000、9000/9000、6000/12000）进行分析比较，包被原及抗体稀释倍数均为9000倍的Amax值最大、IC50值较小和 Amax/IC50值最大，综合考虑选择（9000，9000）这个组合作为包被原和抗体的最佳稀释倍数。

ic-ELISA是一种基于抗原与抗体的生物化学反应，故在合适的温度下，可提高抗原与抗体的结合反应率。本研究比较了 37 ℃和 4 ℃两种包被条件的Amax、Amax/IC50和 IC50，由图 4b可知，Amax和Amax/IC50均相差不大，但37 ℃的IC50要比4 ℃的小，因此选其作为最佳包被温度。

对抗体和标准品稀释液进行优化可以降低空白值，提高方法准确性。本研究将PBST、PBS、Tris-HCl三种稀释液两两组合为9种搭配，如图4（c1-c3）所示，抗体/标准品稀释液是 Tris-HCl/PBS溶液的组合IC50较低，Amax、Amax/IC50较高，因此选其作为抗体和药物的最优稀释液组合。

对抗原抗体反应时间进行优化，可以提高方法的灵敏度及重复性，是实验中的关键环节。本研究选取20、30、40、50和60 min五种竞争反应时间进行分析，结果如图4d所示。由图可知，在40 min时的IC50较小，Amax、Amax/IC50较大，因此选择40 min作为抗原抗体的竞争时间。

在上述优化的条件下，本研究对酶标二抗稀释液进行优化，可提高方法的稳定性和灵敏度。本实验分析了三种不同稀释液（PBS，PBST和Tris-HCl）对实验结果的影响，由图4e可得，酶标二抗稀释液为PBST溶液时的IC50值最低，Amax较高，Amax/IC50最高，因此选其作为最佳的酶标二抗稀释液。

2.4 ic-ELISA标准曲线的建立

根据上述ic-ELISA条件优化结果，得到PcAb-2C的包被原与抗体最佳稀释倍数均为9000倍，包被温度为37 ℃，最佳竞争反应时间为40 min，抗体稀释液为Tris-HCl，标准品稀释液为PBS，酶标二抗稀释液为 PBST。在此最佳反应条件下绘制标准曲线，结果如图5所示，得到PcAb-2C的灵敏度良好（IC50为54.07 ng/mL，最低检测限为7.22 ng/mL），相关系数为0.99，曲线拟合度好，线性范围为12.56～282.62 ng/mL，线性范围广。与 Hegedűs等[32]测得的灵敏度相比略低（IC50为1.89～15.04 ng/mL），但也处于良好范围内。

2.5 特异性鉴定

表1 氟乐灵与20种结构类似物的交叉反应数据Table 1 Cross-reaction data of trifluralin with 20 structural analogues

续表1

表2 ic-ELISA和GC-ECD测定的回收率和变异系数Table 2 Recovery rate and coefficient of variation determined by ic-ELISA and GC-ECD

用所建立方法进行检测，测定IC50值并计算交叉反应率，考察所制备抗体对氟乐灵结构类似药物的识别能力，交叉反应率越低，特异性越好。在20种与氟乐灵结构或者功能相似的类似药物检测过程中（见表1），发现本研究所建立的检测方法仅与FCRL和G-031有较高的交叉反应率（15%以上），与其它18种类似物均在10%以下，甚至一半没有产生交叉反应，说明所建立方法特异性高。与Hegedűs等[32]建立的酶联免疫分析方法相比，本研究选取的结构类似药物范围更广（Hegedűs等选取药物17种），IPPL和PDTL的交叉反应率更低，特异性更好。选取3个具有较高交叉反应率的分子（氟乐灵、FCRL和G-031）进行分析，发现FCRL仅在N-丙基末端连接了-Cl（基团体积和电负性增大）和G-031仅将三氟甲基换成-COOH（基团体积增大但电负性降低），造成交叉反应率降低，由此推测 N-丙基和三氟甲基这两个部位的基团体积和电负性改变很可能会影响抗原抗体的识别。

2.6 添加回收实验与方法确证结果

本文以所建立的方法（ic-ELISA）为检测手段，对鳗鱼、对虾、大豆、大豆油进行添加回收实验，结果如表 2所示。由表可知，ic-ELISA方法测得的PcAb-2C的平均回收率为89.8%～106.4%，GC-ECD方法测得的平均回收率为89.0%～108.2%，两种方法的变异系数均小于10%。对ic-ELISA方法和GC-ECD方法的测定结果进行线性回归分析R2=0.99，相关性好，说明本研究建立的 ic-ELISA方法准确度能达到检测要求，适用于实际样品中氟乐灵的高通量免疫快速检测。Hegedűs等[32]运用所建立的酶联免疫分析方法对胡萝卜汁、南瓜汁和西红柿汁进行检测，添加回收率约为50%～333.3%，与之相比本研究准确度更高。

3 结论

本研究利用 3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯与仲胺侧链氨基发生反应制备氟乐灵半抗原，通过碳二亚胺法偶联合成完全抗原并免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体PcAb-2C。基于上述研究，通过优化包被原和抗体的稀释倍数、包被温度、抗体和标准品稀释液等7个因素，建立了氟乐灵间接竞争酶联免疫分析方法。结果表明该方法的灵敏度良好（IC50为54.07 ng/mL，最低检测限为7.22 ng/mL），曲线拟合度好（相关系数为0.99），线性范围广（IC20～IC80为 12.56～282.62 ng/mL），特异性高（20种氟乐灵结构类似物中只有2种药物的交叉反应率大于 15%）。利用本研究所建立方法对大豆、大豆油、对虾和鳗鱼进行实际样品检测，添加回收率为89.8%～106.4%，采用气相色谱法（GC-ECD）进行验证，添加回收率为 89%～108.2%，两种方法的变异系数均小于 10%，两种方法的一致性较高（R2=0.99）。以上数据表明本研究所建立方法具有灵敏度好、特异性好、准确度高等优点，达到了国家标准检测要求[24]（食用油中氟乐灵最大残留限量为 50 μg/kg），适用于农（水）产品中氟乐灵农药残留的高通量快速检测，为氟乐灵试剂盒或试纸条的开发提供了理论依据。