鲜切苦菊、生菜和紫甘蓝上假单胞菌的分离鉴定及其噬菌体的初步筛选

杨园平，潘旬，雷智栋，石慧

（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

鲜切蔬菜是经清洗、切割、包装等加工过程制成的即食产品，是人类饮食的重要组成部分[1]，是人类摄取矿物质和维生素的重要来源，其高含量的维生素、纤维、矿物质和抗氧化物质是有益人体健康的重要因素[2]，既保留鲜切蔬菜原有的物理、化学、感官和营养特性，可利用度高（100%可食用）[3]，又满足消费者对于天然、营养、新鲜、方便的生活方式的需求。随着人们生活节奏的加快以及对轻食健康生活方式的追求，人们对鲜切苦菊、生菜和紫甘蓝的关注度越来越高，其凭借新鲜、方便、环保及健康的特点已成为国内外蔬菜加工的主流。苦菊嫩叶中氨基酸种类齐全，蛋白质、膳食纤维含量较高；生菜富含维生素、纤维素、矿物质等多种营养物质；紫甘蓝富含多酚、花色苷及硫代葡萄糖苷等营养成分。然而，水果蔬菜是属于易腐败易变质的农产品[4]，巨量的果蔬浪费是全球面临难题[5]。

鲜切果蔬在从收获、加工、包装、运输，最后到销售的过程中都会发生微生物的污染，导致鲜切果蔬上的微生物种群发生改变[6,7]。在加工过程中，鲜切果蔬因为本身高水分的特性，再加上鲜切生菜加工过程中的物理损伤导致的伤口暴露，汁液流出，提供给微生物有益的生存环境和营养物质，使微生物大量繁殖，导致鲜切果蔬加快腐败变质。因此，鉴定出果蔬中常见优势腐败菌，从而针对性加以控制，以期更好地延长其保质期就尤为重要。

在很多研究中都证明假单胞菌属（Pseudomonasspp.）是鲜切蔬菜叶面上的主要腐败菌[8-10]，通过产生水解酶（果胶酶），致使蔬菜软腐烂。保持低温是常用的抑制腐败菌生长繁殖的手段，但某些假单胞菌是嗜冷菌，因此在冷藏保存的鲜切蔬菜上，它们可以正常繁殖[11]。常见的假单胞菌有铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）[12]。其中铜绿假单胞菌是条件致病菌[13]，可引起人严重感染，包括败血症、肺炎、心内膜炎、中耳炎和角膜炎等[14]；荧光假单胞菌在4 ℃时繁殖速度很快，是低温状态下常见腐败菌，人感染了会引起败血症、感染性休克、血管内凝血等后果[15]。

噬菌体是专门攻击细菌，并在其细胞内繁殖的一类病毒，对其他类型的细胞没有影响[16]。噬菌体在自然界中广泛分布[17]，且其具有高度特异性，一种噬菌体只针对某一种细菌，通常在单独属或种内有特异性，因此它不会影响其他非目标细菌[18]，这也使得噬菌体可被应用于鲜切蔬菜中针对性地杀灭假单胞腐败菌。利用噬菌体控制铜绿假单胞菌的感染在医疗方面被广泛应用，许多研究表明铜绿假单胞菌噬菌体可有效控制由其引起的呼吸道感染[19]、肺部感染[20]等，荧光假单胞菌主要引起食物腐败，Nascimento等人[21]分离得到一株荧光假单胞菌噬菌体并进行抑菌应用，结果表明噬菌体对变质乳中的荧光假单胞菌具有跟大抑菌潜力。Zhang等人[22]利用沙门氏菌噬菌体的内溶酶成功对液体样品和固体样品中的铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌进行了有效控制，并对他们在各种固体表面形成的生物膜进行了抑菌研究，但关于利用噬菌体控制鲜切蔬菜上的假单胞菌鲜有研究。

本研究以鲜切苦菊、生菜和紫甘蓝为研究对象，从中筛选分离得到4株假单胞菌并对其鉴定，以鉴定出的两株假单胞菌为宿主菌筛选分离得到噬菌体。再将这两株假单胞菌回接至灭菌的三种鲜切蔬菜中，鉴定其致腐能力。对于进一步了解鲜切蔬菜中的假单胞菌至关重要，以便有针对性地对鲜切蔬菜中的假单胞菌加以控制，为鲜切蔬菜的保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

1.1.1 实验样品

鲜切生菜，鲜切苦菊，鲜切紫甘蓝均购于北碚区永辉超市、天生菜市场及渝北区新世纪超市，共9个样品；噬菌体实验所用的水样源于重庆市北碚区龙凤溪与嘉陵江。

1.1.2 实验试剂

假单胞菌（CFC）培养基、LB肉汤、PALCAM琼脂、胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA），青岛高科园海博生物技术有限公司；agar琼脂，上海源叶生物科技有限公司；全式金试剂盒，北京三药科技开发公司；二甲亚砜，上海生工生物工程有限公司；次氯酸钠、乙醇（95%）、丙三醇、盐酸，重庆川东化工有限公司；氯化钙（分析纯）、氯化钠（分析纯），上海泰坦科技股份有限公司；MgSO4·7H2O（分析纯），成都市科龙化工试剂厂；Tris（分析纯），索莱宝生物技术有限公司；SM 缓冲液（由 NaCl、MgSO4·7H2O、Tris-HCl和蒸馏水按一定比例配制）。

1.1.3 主要仪器设备

SQP电子天平，Sartorius；DHP-9272恒温培养箱、MX-F微型涡旋混合仪、DK-98-II万用电炉，上海泸西分析仪器有限公司；BHC-1300IIA/B3生物安全柜，苏州净化设备有限公司；LDZF-30KB立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械有限公司；10-1000 μL移液器，上海泰坦科技股份有限公司；DZF-6021鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；BCD-649W普通冰箱，青岛海尔集团；SW-CJ-FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；VeritiTM2720 PCR热循环仪，赛默飞世尔中国；Mill-Q纯水系统，Merck Millipore；U410超低温冰箱，NEW BRUNSWICK Premium；THZ-D恒温摇床，江苏太仓市实验设备厂；5810R冷冻高速离心机，Eppendorf；ZF-90多功能暗箱紫外透射仪，上海宝山顾村电光仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 假单胞菌的分离与鉴定

剪取5 g腐败样品于50 mL锥形瓶，加入45 mL 0.85%生理盐水，振荡，静置，制成菌液。吸取50 μL菌液，涂布于假单胞菌（CFC）选择培养基，放入37 ℃培养箱，培养48 h。挑取培养基上形态不同的菌落，在假单胞菌（CFC）培养基上进行平板划线，放入37 ℃培养箱，培养48 h。重复平板划线，直至获得大小、形态相同的菌落。

将纯化后的菌株提取DNA，用全式金DNA提取试剂盒依据说明书提取 DNA，提取的 DNA产物于-20 ℃保存。称取2.5 g琼脂糖置于25 mL TAE电泳缓冲液中，称重，加热融化，然后用TAE配平，趁热加入染料，待温度降至 60 ℃左右时，均匀铺板，制成1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样（DNA示踪剂染色），以200 V，120 mA进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，用凝胶成像仪观察记录结果。

表1 PCR试剂及用量Table 1 PCR reagents and dosage

PCR扩增，将提取的DNA进行PCR扩增，正向引物为 27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），反向引物为1492 R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3’）[23]，总体系为30 μL，其中各种试剂及用量见表1。PCR扩增程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循环30次；72 ℃延伸5 min：4 ℃保存。PCR产物测序，由上海生物工程公司测序，生物工程（上海）公司完成，测序结果在NCBI网站，BLAST数据库中进行同源性搜索，选取同源性较高的序列，用软件 MAGE-X中的Neighbor-Joining构建系统发育进化树。

1.2.2 假单胞菌致腐能力鉴定

在超净灭菌台中，挑取单菌落于30 mL LB培养液，摇床培养16 h，制成菌悬液。将鲜切菜样本纯水冲洗，洗去表面泥土，摘去外层叶片和不健康的叶片，用灭菌后的剪刀分成大小均一的组织片，再用 200 mg/kg次氯酸钠溶液浸泡10 min，再用无菌纯水冲洗，晾干。在超净灭菌台中，将处理过的鲜切菜组织片，分别浸泡0.85%生理盐水（作为对照）和稀释10倍后的菌悬液，装入灭菌后的保险密封袋，室温保存，每天对蔬菜进行感官评定分析[24]，观察记录鲜切蔬菜的组织结构、颜色与气味，进而评价鲜切蔬菜的腐败程度。

1.2.3 噬菌体的分离与纯化

从重庆市北碚区龙凤溪水与嘉陵江采集水样，水样通过滤纸过滤，加入终浓度为1 mmol/L的CaCl2[25]，在8000 ×g离心4 min，取上清液用无菌0.22 μm滤膜过滤到无菌容器。将纯化后的假单胞菌挑取单菌落接种到LB培养基中并过夜培养。将处理后的水样与过夜培养的宿主菌混匀加入2× LB培养基中过夜培养。培养液离心后收集上清液，上清液通过0.22 μm滤膜过滤。取10 μL滤液滴在含有宿主菌的双层板中并观察噬菌斑[26]。

利用双层平板法纯化噬菌体。用无菌牙签挑取双层板上的噬菌斑加入1 mL的SM缓冲液震荡混匀后静置20 min，离心后取上清液到无菌容器中。将上清液10倍稀释后，取稀释液与等体积的假单胞菌菌液混合均匀，并在室温下静置15 min。将混合物全部加入5 mL LB soft agar中混匀，倾倒在TSA板上。待上层软琼脂凝固后，倒置放于37 ℃培养16 h，挑取大且透亮的单斑加入1 mL的SM缓冲液中，重复上述的步骤5～6次，直到得到大小、形态相同的单斑为止。将纯化后的噬菌体加入10%二甲亚砜溶液混合均匀后于-80 ℃保藏。

1.2.4 噬菌体对假单胞菌生长的抑制作用

挑取假单胞菌的单菌落于37 ℃、120 r/min下培养至对数初期，OD600nm为0.2。取4 mL对数初期菌液与1 mL噬菌体上清液加入10 mL LB培养基中，对照组加入1 mL LB培养液，放置于37 ℃摇床内培养，每隔1 h取出测OD600nm，共8 h，实验进行三组重复。

1.2.5 数据统计分析

实验进行三组重复。本研究中所得数据在 Excel 2016中统计，采用SPSS（version 22.0）软件对数据进行统计分析，p＜0.05认为差异具有统计学意义。使用GraphPad Prism 8.0对数据进行作图，运用ANOVA进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 鲜切蔬菜中假单胞菌的分离与鉴定

将9份鲜切蔬菜样本稀释涂布于假单胞菌（CFC）培养基上进行菌落培养，共培养出四种菌落形态明显不同的菌株，分别为菌株A、菌株B、菌株C和菌株D。观察其菌落和形态特征，在 CFC选择培养基上37 ℃培养48 h，菌株A的菌落颜色为绿色，菌落表面有光泽，菌落形状为扁平湿润，不透明，边缘轻微波状（图1a）；菌株B的菌落颜色为黄绿色，菌落表面有光泽，菌落形状为粘稠湿润，不透明，边缘不完整（图1b）；菌株C的菌落颜色为黄色，菌落表面有光泽，菌落形状为圆形，半透明，稍凸起，边缘完整光滑（图1c）；菌株D的菌落颜色为黄色，菌落形状为圆形，较透明，中心稍隆起，边缘轻微波状（图1d）。

利用平板划线法对鲜切蔬菜中的四种未知菌株进行分离纯化，采用16S rRNA的PCR扩增和基因序列分析方法[27]将筛选得到的四种未知菌株以总DNA为模板PCR扩增后经电泳检测，电泳凝胶上显示出明显的条带，假单胞菌DNA均大于2000 bp，其PCR扩增产物均为1500 bp（图2）。PCR产物由上海生物工程公司测序，测得它们的 16S rRNA序列后用SnapGene数据库进行序列比对。图3～6为四种未知菌株的16S rRNA基因序列比对结果在NCBI网站上进行BLAST同源性匹配的菌株，并用软件MEGA-X中的Neighbor-Joining构建系统发育进化树。

由系统发育进化树结合菌落及形态特征可得：未知菌株A与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的DNA匹配率最高，BLAST同源性为99%。未知菌株B与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DNA匹配率最高，BLAST同源性为99%。未知菌株C与荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）DNA匹配率较高，BLAST同源性为99%。未知菌株D与湖南假单胞菌（Pseudomonas hunanensis）DNA匹配率最高，BLAST同源性为100%。

结果表明，在检测的9份样品中，共筛选得到2株铜绿假单胞菌、1株荧光假单胞菌和1株湖南假单胞菌。其中来自永辉超市和天生菜市场的三种鲜切蔬菜样品中含有一种具有相同菌落形态和颜色的假单胞菌，来自新世纪超市的三种鲜切蔬菜样本中均含有两种不同菌落形态和颜色的假单胞菌，说明不同来源的鲜切蔬菜上的假单胞菌具有多样性。

2.2 铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌致腐能力鉴定

将铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌经纯化后制成菌液，接种至灭菌鲜切蔬菜进行回接实验，对比三种蔬菜组织结构：苦菊最为细软，叶片最薄，分叉最多，水分中等；生菜，叶片厚度中等，水分最多，叶片软脆；紫甘蓝叶片最厚，水分最少，叶片硬脆。苦菊样品在第3 d均出现腐败现象，相同保存时间下，0.85%生理盐水处理后的苦菊样品腐败程度最低，腐败的叶片数量最少，未流出腐败组织液。荧光假单胞菌回接后的苦菊样品腐败程度其次，腐败的叶片数量其次，汁液较少。铜绿假单胞菌回接后的苦菊样品腐败程度最强，腐败叶片数量最多，汁液较多，散发恶臭，致呕（图7）；生菜样品则在第4 d有明显腐败现象，0.85%生理盐水处理后的生菜样品腐败程度最低，腐败的叶片数量最少，未流出腐败组织液。荧光假单胞菌回接后的生菜样品腐败程度其次，腐败的叶片数量其次，汁液较少。铜绿假单胞菌回接后的生菜样品腐败程度最强，腐败叶片数量最多，汁液较多，散发恶臭，致呕（图8）；紫甘蓝在第6 d出现腐败现象，0.85%生理盐水处理后的紫甘蓝样品腐败程度最低，腐败的叶片数量最少，未流出腐败组织液，叶片横截面为白色。荧光假单胞菌回接后的紫甘蓝样品腐败程度其次，腐败的叶片数量其次，紫色汁液较少，叶片横截面为灰色。铜绿假单胞菌回接后的紫甘蓝样品腐败程度最强，腐败叶片数量最多，紫色汁液较多，叶片横截面为黄色，散发恶臭，致呕（图9）。当苦菊大部分腐败的时候，生菜才开始有明显的腐败现象，当生菜大部分腐败的时候，紫甘蓝才开始有轻微腐败现象。由此可知，铜绿假单胞菌的致腐能力比荧光假单胞菌强，且在同种假单胞菌影响下的鲜切蔬菜腐败速度从快到慢为：苦菊、生菜、紫甘蓝。

2.3 噬菌体的筛选分离

噬菌体的富集培养液与铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌作双层平板时出现了噬菌斑，说明噬菌体富集培养液中有针对这两株假单胞菌的噬菌体。反复挑单斑纯化，获得两株较纯的噬菌体，分别命名为vB_Pae_503-1和vB_Pfl_503-2。vB_Pae_503-1的噬菌斑边缘整齐、清晰透亮（图10a）；噬菌体vB_Pfl_503-2、的噬菌斑边缘整齐、中间清晰透亮且周围有晕圈（图10b）。

2.4 噬菌体对铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌生长的抑制作用

为了评估噬菌体对宿主菌生长的抑制作用，使用噬菌体vB_Pae_503-1和vB_Pfl_503-2分别感染铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌，检测两种假单胞菌OD600nm的变化。从5 h开始，噬菌体vB_Pae_503-1和vB_Pfl_503-2对宿主菌的抑制作用都显著增加。噬菌体vB_Pae_503-1从2 h开始抑制铜绿假单胞菌的生长并持续了6 h。铜绿假单胞菌的OD600nm在8 h时相比于对照组降低了0.42（图11a）。噬菌体vB_Pfl_503-2从1 h开始抑制荧光假单胞菌的生长并持续了8 h。荧光假单胞菌的OD600nm在8 h时相比于对照组降低了0.38（图 11b）；结果表明，噬菌体 vB_Pae_503-1和vB_Pfl_503-2可以有效地控制铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌的生长，显示出良好的抑菌潜力。

3 结论

3.1 本研究对鲜切苦菊、生菜和紫甘蓝中的假单胞菌进行分离鉴定，结合菌落形态、菌体特征观察及16S rRNA基因序列分析方法，筛选得到2株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginonas）、1株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和1株湖南假单胞菌（Pseudomonas hunanensis）。将铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌回接到三种鲜切蔬菜中，证实了铜绿假单胞菌的致腐能力明显比荧光假单胞菌强，并发现不同鲜切蔬菜的腐败速度不一样，腐败速度由快到慢：苦菊、生菜、紫甘蓝。

3.2 此外，本研究以分离鉴定的铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌为宿主，从环境水样中筛选分离了噬菌体vB_Pae_503-1和 vB_Pfl_503-2，可以持续控制假单胞菌引起的腐败，其具有开发为生物制剂控制假单胞菌感染的潜力，为控制鲜切蔬菜中的假单胞菌提供了新的策略。需要进一步研究本文分离鉴定的假单胞菌在各种条件下对鲜切蔬菜的致腐能力以及噬菌体vB_Pae_503-1和vB_Pfl_503-2的生物学特性，从而评估其在假单胞菌腐败防治中的潜在应用。