自贡冷吃兔生产环境中细菌的鉴定及溯源分析

袁先铃，郑贻丹，罗燚，林洪斌

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644005）（2.西华大学食品与生物工程学院，四川成都 610039）

自贡冷吃兔是自贡乃至川南地区的一种特色传统肉制品，以鲜兔肉为原料，辅以辣椒、花椒、姜等香辛料，经预煮、腌制、炒制等工艺加工而成[1]。目前，自贡冷吃兔的品种有冷吃兔丁、香辣兔头、兔腿，口味有香辣味、麻辣味、酱香味、无香味等[2]。兔肉质地细嫩，味道鲜美，营养丰富，颇受消费者的喜爱[3-5]。兔产业目前发展迅速尤其是在发展中地区并且世界兔产业具有巨大的发展潜力[6]。根据自贡市统计局公布数据显示，2014～2017年，自贡市从事冷吃兔加工企业数量10余家增至60余家，以“前店后厂”模式生产加工冷吃兔的小作坊达100多户增至1000余户，其中每年规模以上加工企业数量呈现逐年增加趋势[7]。2014年自贡市冷吃兔的产值为 2.5亿，2018年增至13.5 亿[8]。

生产环境中存在多种致病性、变质性微生物造成的微生物污染，可能会损害食品安全和质量。食品和生产环境监测相结合，是提高食品安全和质量的杠杆[9]。

自贡冷吃兔属于高温肉制品，能够达到商业无菌，但仍会残存部分细菌。在熟肉制品中，乳酸菌、葡萄球菌以及肠杆菌常被分离出来[10-11]。Yi等[12]对36种熏肉进行研究，发现鞘氨单胞菌（Sphingomonas）、假单胞菌（Pseudomonas）、葡萄球菌（staphycoccus）、明串珠菌（Leuconostoc）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的丰度较高。李冉等[13]对气调包装狮子头冷藏过程中微生物变化及菌群结构分析，发现狮子头腐败时期的菌群结构主要由芽孢杆菌属（Bacillusspp.）、假单胞菌属（Pseudomonasspp.）、链球菌属（Streptococcusspp.）、不动杆菌属（Acinetobaceterspp.）、热杀索丝菌属（Brochothrixspp.）、肠杆菌属（Enterobacterspp.）、乳酸菌属（Lactobacillusspp.）以及嗜冷杆菌属（Psychrobacterspp.）组成。图尔荪阿依·图尔贡等[14]从腐败香辣蟹中分离出 15株腐败菌，其中 3株属于葡萄球菌属（Staphylococcussp.)，6株属于白色杆菌属（Leucobactersp.)，3 株属于变形杆菌属（Proteussp.），2株属于普罗威登斯菌（Providencia vermicola），1株属于节杆菌属（Arthrobactersp.）。

本研究通过对自贡冷吃兔生产加工车间、生产器具与设备、操作人员手的微生物进行数量测定，分离筛选出主要微生物，了解自贡冷吃兔加工生产过程中细菌污染状况及其分布情况，为确定关键控制点与污染源、规范操作流程，构建自贡冷吃兔污染微生物数据库提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

采样于四川省自贡市某冷吃兔工厂。

主要试剂：PCA平板计数琼脂、Baird-Parker琼脂基础、MRS培养基、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）、LB培养基和亚蹄酸盐卵黄增菌液，购于青岛海博生物技术有限公司；氯化钠（分析纯）购于上海源叶生物科技有限公司；甘油购于上海麦克林生化科技有限公司；1×TSE101金牌mix、TSINGKE高纯度低电渗琼脂糖、DNA凝胶回收试剂盒和DL5000 Marker购于Tsingke。

主要设备：HLD-30002电子天平，杭州友恒称重设备有限公司；DK-98-11万用电炉，北京科伟永兴仪器有限公司；LS-75HD立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司；101-3AB数显恒温鼓风干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司；DZKW-D-2电热恒温水浴锅，上海科恒实业发展有限公司；Hws-250B恒温恒湿培养箱，天津市宏诺仪器有限公司；SW-CJ-2FD净化工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；QYC-2102双层小容量全温恒温摇床，上海福玛实验设备有限公司；3730XL测序仪，Applied Biosystems；Legend Micro17离心机，Thermo；2720 thermal cyclerPCR仪，Applied Biosystems；JY300C电泳仪、JYDF(定制)电泳槽、JY04S-3C凝胶成像仪，君意东方；DFD-700水浴锅，北京中兴伟业；L550板式离心机，cence湘仪。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的采集

1.2.1.1 采样方法

涂抹采样：用经杀菌后蘸有无菌生理盐水棉球擦拭取样框内表面（框内面积为 50 cm2），擦完后将棉球放入盛有10 mL无菌生理盐水的试管中，此试管中溶液每1 mL代表5 cm2，密封带回微生物室备用[15]。

自然沉降法：参考GB/T 18204《公共场所卫生检验方法 第3部分：空气微生物》中自然沉降法进行采样[16]。

1.2.1.2 采样位置

生产器具：主要针对生产中与冷吃兔半成品、成品有接触的器具，包括切刀、沥水器具、盛放器具、转移器具、摊凉器具、预煮机内壁、腌制机内壁、炸制机内壁、炒制机内壁，采用涂抹取样。

人员：宰切人员、预煮人员、腌制人员、炸制人员、包装人员，采用涂抹取样。

生产车间：原料处理间、辅料处理间、辅料储存间、炒制间、冷却间、包装间，采用自然沉降法。

1.2.2 生产环境中细菌数量测定

参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[17]、GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》[18]、GB 4789.41-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验》[19]和GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》[20]对原辅料进行菌落总数、乳酸菌数量、肠杆菌数数量、葡萄球菌数量测定，在无菌条件下，将取样与225 mL无菌生理盐水混合，震荡混匀5 min，将样品悬液10倍梯度稀释，选取3个稀释度，分别接种至不同培养基，每个稀释度做2个重复，各种微生物选择培养基及其培养条件列于表 1。培养结束后，记录各种培养基上菌落数量。

表1 细菌的培养条件Table 1 Bacterial culture conditions

表2 冷吃兔生产车间菌落总数数量变化Table 2 Changes in the total number of colonies in the cold-eating rabbit production workshop

1.2.3 生产环境中细菌的分离纯化

挑选菌落数量测定后菌落数量在 30～300的培养基，观察菌落的颜色、大小、形态、边缘结构、隆起程度、光泽度及透明度等特征。挑选典型菌落，进行革兰氏染色，在显微镜下观察，并进行划线分离纯化，至少进行3次划线，直至得到纯化单菌落。挑取纯菌落于LB培养基中，过夜培养，加入终浓度为20%的甘油，-20 ℃保藏、备用。

1.2.4 细菌的分子鉴定

1.2.4.1 扩增与测序

取1 mL保藏的菌液转接于LB培养基，37 ℃过夜培养，4 ℃，8000 r/min离心10 min，弃上清，获得细菌菌体沉淀。采用TSINGKE植物DNA提取试剂盒（通用型）提取纯化菌株的DNA，以提取的DNA样品作为模版，采用16S rDNA细菌通用引物27F：5’-AGT TTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCT TGTTACGACTT-3’为引物，PCR扩增反应体系为25 μL：上下游引物各1 μL，模版2 μL，10 μL 2×Tap Master Mix，补ddH2O至25 μL。反应程序为：98 ℃预变性2 min，38 个循环（98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s），72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.2.4.2 序列比对分析

将返回的16S rDNA基因测序结果通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库对各菌株进行 Blast相似序列检索，选取同源性高的菌株序列（≥99%），以确定细菌种类。

1.2.5 数据的处理

每组实验均进行 3次及以上平行测定，采用Microsoft Excel 2016、SPSS Statistics 22和 Oringin 2019对实验数据进行处理、统计和制图。

2 结果与讨论

2.1 生产车间空气微生物数量变化

利用自然沉降法对冷吃兔生产车间（辅料处理间、辅料储存间、原料处理间、炒制间、冷却间、内包装间）进行微生物检测，结果如表2所示。根据国家标准GB/T 17093-1997《室内空气中细菌总数卫生标准》[21]，对室内空气细菌总数做了限量规定，采用自然沉降法的标准值为≤45 CFU/皿。在一个生产周期内，辅料处理间、辅料储存间沉降细菌总数为1 CFU/皿且基本不变，原料处理间、炒制间、冷却间、内包装间的微生物数量变化较大，原料处理间生产前（0 h）微生物沉降数目为2.5 CFU/皿，在生产1 h后达到22 CFU/皿，炒制间初始沉降数目为 2 CFU/皿，最高时为 7 CFU/皿，冷却间和内包装间微生物数量在加工中保持低值，各车间细菌沉降总数均远小于≤45 CFU/皿，清洁程度高符合国家标准。人员的流动是车间微生物变化的重要原因，宰切原料时剧烈震动是原料处理间沉降菌数目变化的主要原因。

2.2 人员与生产器具细菌变化

在一个生产周期内，对冷吃兔生产工序中与半成品、成品有接触机会的各器具、设备和人员进行微生物监测，结果如表3所示。根据国家标准食品生产通用卫生规范及相关卫生操作程序，对生产过程中与食品接触的接触物表面菌落总数建议标准为：低于 50 CFU/cm2为极满意水平，在50～104CFU/cm2之间为可接受水平，高于 104CFU/cm2为不可接受水平[22,23]。据此，在生产加工前各人员和加工器具表面菌落总数均大于 104CFU/cm2，经过生产之前清洗杀菌步骤，与冷吃兔加工过程有接触的宰切人员1、宰切人员2、预煮人员、腌制人员、炸制人员、炒制人员和沥水网的表面微生物菌落总数分别为5.63 lg(CFU/cm2)、5.09 lg(CFU/cm2)、5.03 lg(CFU/cm2)、5.26 lg(CFU/cm2)、5.03 lg(CFU/cm2)、4.84 lg(CFU/cm2)、4.78 lg(CFU/cm2)，仍处于104CFU/cm2以上，疑似为冷吃兔成品中腐败细菌的主要来源。生产前后，冷吃兔生产人员、设备与器具分别进行消毒，能显著降低接触物表面细菌总数。在生产中，宰切、预煮、腌制人员手表面细菌总数均上升，炒制和炸制人员手表面细菌总数稍微下降，包装人员手表面细菌总数保持稳定，可能是宰切、预煮、腌制人员与原料兔肉接触紧密，炒制和炸制人员生产环境高，包装人员生产车间洁净且经过严格消毒环节。各生产器具接触表面细菌呈上升趋势，主要是原辅料接触形成交叉污染；设备接触表面细菌总数变化与加工温度变化相关。孟静[24]研究发现，在鸭肉制品生产过程中，车间空气、解冻水及所用器具接触面都是鸭肉制品潜在污染源，这与本研究结果一致。包装人员、解剖刀、切刀、转移器具、盛放容器和摊凉容器，在冷吃兔生产加工前执行严格的清洗或消毒环节，表面细菌总数均小于 104CFU/cm2，符合清洁作业标准。预煮机内壁、卤制机内壁、炸制机内壁和炒制机内壁经清洗消毒，且在加工过程中温度维持 80 ℃以上，表面细菌得到良好控制，但其残存的细菌具备耐高温特点，极易成为冷吃兔腐败细菌的污染源。加工过程中，操作人员手表面菌落总数平均最高，可能是在操作过程中与兔肉、兔血等直接接触造成的，应当执行严格的生产卫生操作程序，并佩戴一次性手套，避免手与兔肉交叉污染。

表3 冷吃兔生产操作人员及器具菌落总数数量变化Table 3 Changes in total number of colonies of the production operators and utensils of cold-eating rabbits

2.3 细菌生理形态特征分析

通过4种选择培养基对冷吃兔生产车间、人员以及各种加工设备的细菌进行稀释涂布筛选，至少3次平板划线得到单菌落，共分离到59株菌，选取数量占比大的菌株进行菌落形态特征描述，见表4。

2.4 16S rDNA PCR扩增产物电泳图谱

对分离纯化得到的细菌单菌落采用试剂盒提取DNA片段，并用通用引物27F/1492R进行PCR扩增，通过 1%琼脂糖凝胶电泳检测，选取其中部分菌株电泳图，如图1所示。

如图1所示，均得到大约1500 bp的PCR扩增片段，条带明亮清晰，满足后续测序要求，随后送往北京擎科生物科技有限公司测序。

2.5 菌种鉴定结果

用ContigExpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分，将拼接好的序列在 NCBI数据库（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行比对，选取同源性最高的菌株序列，结果如表5、6、7所示。

2.5.1 生产车间空气中细菌

通过对车间微生物进行菌落总数测定，从琼脂平板中筛选特征菌落，分离纯化后送检测序鉴定，结果如表5所示。辅料储存与处理间相通，其空气中菌落组成相同，主要有巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）[25]、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）[26]两种菌构成。从原料处理间空气中共鉴定出5株菌，其中Z1、Z5属于嗜根考克氏菌（Kocuria rhizophila）[27]，Z2属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[28]，Z3属于法氏沃氏黄杆菌（Wautersiella falsenii）[29]，Z4属于碘短杆菌（Brevibacterium iodinum）[30]，与酸乳生产车间空气分离结果一致[31]。从冷吃兔炒制间空气中共鉴定出6株菌，其中1株浅绿气球菌（Aerococcus viridans）[32]，2 株（C5、C6）鲁氏不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）[33]，3株属于葡萄球菌属（Staphylococcus），C2被鉴定为科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）[34]、C3与C4被鉴定为腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）[35]，这与刘卫德等的研究结果相似[36]。冷却间与内包间相通，筛选出2株菌，分别为N1解琼胶烂泥杆菌（Macrococcus goetzii）[37]和弗氏志贺菌（Shigella flexneri）[38]。考克氏菌属、不动杆菌属、葡萄球菌属普遍存在于肉制品生产车间空气[24,39-41]。

表4 部分细菌的菌落特征与形态Table 4 Colony characteristics and morphology of some bacteria

表5 生产车间空气中细菌鉴定结果Table 5 Bacteria identification results in the air of the production workshop

表6 生产器具表面细菌鉴定结果Table 6 Identification results of bacteria on the surface of production equipment

2.5.2 生产器具表面细菌

各生产器具表面细菌种类组成相似性，可能存在交叉污染，如表6所示，从生产器具表面共分离到17株菌，分布于10个属，其中不动杆菌属（Acinetobacter）6株，J2、J4为不动杆菌（Acinetobactersp.）[42]，J3、J10与J12为约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）[43]，J17为包氏不动杆菌（Acinetobacter bouvetii）[44]；2株假单胞菌属（Pseudomonas），J5为假单胞菌（Pseudomonassp.）[45]、J14为莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）[46]；2株属于沃氏菌属（Wautersiella），J6 为沃氏菌（Wautersiellasp.），J7为法氏沃氏黄杆菌（Wautersiella falsenii）[29]；其余7株为别是：J1是菊微小杆菌（Exiguobacterium indicum）[47]、J8 厦门希瓦氏菌（Shewanella xiamenensis）[48]、J9杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）[49]、J11穆氏柠檬酸杆菌（Citrobacter murliniae）[50]、J13成团泛菌（Pantoea agglomerans）[51]、J15溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）[52]、J16栖冷克品沃尔氏菌（Kluyvera cryocrescens）[53]。主要菌属为不动杆菌属，与柴艳兵研究结果一致[31]，假单胞菌属、气单胞菌属等常见于肉制品加工设备表面，也是冷却肉的重要腐败菌[54-55]。

表7 生产人员手表面细菌鉴定结果Table 7 Identification results of bacteria on the hand surface of production personnel

2.5.3 生产人员手表面细菌

冷吃兔生产车间人员流动大，生产人员手表面细菌菌群结构相似，从生产人员手表面共筛选出 29株菌，如表 7所示。其中 8株属于不动杆菌属（Acinetobacter），R9、R16、R18、R20 与 R26 为约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）[43]，R12、R25为不动杆菌（Acinetobactersp.）[42]，R27为溶血不动杆菌（Acinetobacter haemolyticus）[56]；5株属于气单胞菌属（Aeromonas），R10、R28为中间气单胞菌（Aeromonas media）[57]，R3为豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）[58]，R6为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）[59]，R19为河流气单胞菌（Aeromonas rivipollensis）[60]；4株属于假单胞菌属（Pseudomonas），R8为耐冷假单胞菌（Pseudomonas psychrotolerans）[61]，R11为喜昆虫假单胞菌（Pseudomonas entomophila）[62]，R17为隆德假单胞菌（Pseudomonas lundensis）[63]，R22为副黄假单胞菌（Pseudomonas fulva）；3株微小杆菌属（Exiguobacterium），R14为微小杆菌（Exiguobacteriumsp.）[64]，R15、R24 为菊微小杆菌（Exiguobacterium indicum）[47]；2株属于库特氏菌（Kurthia）[65]，分别为 R7吉氏库特氏菌（Kurthia gibsonii）[66]、R13 佐氏库特氏菌（Kurthia zopfii）[67]；2株属于沙雷氏菌属（Serratia），分别为R2液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）[68]、R5食奎尼酸沙雷氏菌（Serratia quinivorans）[69]；其余分别为R1厦门希瓦氏菌（Shewanella xiamenensis）[49]、R4溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）[70]、R21非脱羧勒克氏菌（Leclercia adecarboxylata）[71]、R23肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）[72]、R29法氏沃氏黄杆菌（Wautersiella falsenii）[29]。其他研究表明[73-77]，葡萄球菌属是操作人员手表面的主要微生物，与本文研究差异性较大，可能是由于冷吃兔生产加工人员在生产前消毒不彻底，且加工过程未佩戴手套，与加工器具、原料等交叉污染。

2.5.4 腐败冷吃兔中的细菌

从腐败终点样品（25 ℃贮藏至产生气泡、胀袋）共筛选16株菌，分属于3个属，11株（FB-1、FB-2、FB-4、FB-6、FB-7、FB-8、FB-9、FB-12、FB-14、FB-15、FB-16）表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）[78]、1株（FB-5）地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）[79]、1株（FB-3）Rummeliibacillus stabekisii[80]、2 株（FB-10、FB-11）Bacillus paralicheniformis[81]、1 株（FB-13）蔬菜芽孢杆菌（Bacillus oleronius）[82]。

表8 腐败冷吃兔中细菌鉴定结果Table 8 Bacteria identification results in spoilage Leng-Chi rabbit

2.6 腐败细菌与生产环境细菌同源性分析

将从腐败冷吃兔筛选得到的 16株腐败菌和生产环境中细菌进行多序列比对，采用 NJ法构建系统发育树，去除低置信度分支，结果如图2所示。样品中葡萄球菌属细菌与R4、C2和C3的同源性极高，说明了加工人员与炒制间空气是葡萄球菌重要的污染源，表皮葡萄球菌是人体皮肤表面的正常菌群，可以推测可能是加工人员的操作和流动，引起了葡萄球菌属细菌的污染。腐败样品中FB-5、FB-11和FB-13与原料处理间Z2处于一个分支，属于芽孢杆菌属细菌，表明了原料处理间空气是样品中芽孢杆菌属细菌的重要来源，可能是由于原料宰切剧烈，与人员、空气形成交叉污染。由表5、6、7可知，从生产环境中分离出61株菌，分别属于21个属，其中16株为不动杆菌属（Acinetobactersp.），6株属于气单胞菌属（Aeromonassp.），6株属于假单胞菌属（Pseudomonassp.），4株属于葡萄球菌属（Staphylococcussp.），4株属于沃氏菌属（Wautersiellasp.），4株微小杆菌属（Exiguobacteriumsp.），2株考克氏菌属（Kocuriasp.），2株库特氏菌属（Kurthiasp.），2株属于巨大球菌属（Macrococcussp.），2 株希瓦氏菌（Shewanellasp.），2株沙雷氏菌（Serratiasp.），其余分别为气球菌属（Aerococcussp.）、柠檬酸杆菌属（Citrobactersp.）、泛菌属（Pantoeasp.）、克吕沃尔氏菌属（Kluyverasp.）、志贺菌属（Shigellasp.）、芽孢杆菌属（Bacillussp.）、短杆菌属（Brevibacteriumsp.）等。从冷吃兔生产环境的优势细菌以不动杆菌属、假单胞菌属、气单胞菌属、葡萄球菌属、沃氏菌属、微小杆菌属为主。不动杆菌属细菌广泛存在肉制品加工环境中，属于非发酵条件致病菌，是许多肉及其肉制品的重要腐败菌[83-86]。假单胞菌属是肉制品、乳制品、水产品等常见腐败菌[87-89]，也是肉制品中常见的嗜冷腐败菌[90]。

3 结论

3.1 通过对生产加工环境中微生物进行检测，分析生产车间空气、生产人员手以及与产品直接接触的设备器具表面微生物数量，筛选分离出主要细菌，发现冷吃兔辅料处理间、辅料储存间、炒制间、冷却间、内包装间的菌落总数在生产过程中变化较小，原料处理间受人员操作影响变化较大。因此，认为冷吃兔加工设备器具表面和人员手部是冷吃兔产品潜在的污染来源。建议在生产之前严格要求生产人员做好消毒步骤，正确佩戴无菌工作服、工作帽与手套，严格做到生产前后对生产设备器具清洗、杀毒、灭菌。从分离结果来看，从生产环境中共分离出61株菌，分别属于21个属，其中生产车间空气、生产人员、设备与器具均检出不动杆菌属细菌，表明不动杆菌属在冷吃兔生产环境中分布广泛，其次为气单胞菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属。真空包装冷吃兔腐败样品中芽孢杆菌属细菌主要来源于各生产车间空气微生物，葡萄球菌属细菌主要来源于炒制人员以及炒制间空气微生物。

3.2 本研究确定生产环境中细菌的主要种属，建立潜在污染细菌库，为完善溯源系统和HACCP体系提供了理论基础。为健全体系，还需探明原辅料中的食源性致病细菌、原料库房的最优储存条件、最优防腐工艺和杀菌工艺，来提高自贡冷吃兔的食用安全性，为传统的冷吃兔生产提供保障。