乙醛对荧光假单胞菌的抑菌活性及机理

钱雄锋，罗怡，张岳玥，李响，鲁子铭，刘梦月，梁东武

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 530000）

微生物活动是造成食品腐败的重要原因之一，每年可导致世界四分之一的食物腐败损失；其中，捕捞后的鱼类约有 30%因为微生物腐败变质而丧失食用价值[1]。嗜冷微生物是水产品中常见的腐败微生物，其生长繁殖常常加速水产品在冷链储运中的品质下降。研究表明，冷藏淡水鱼类的优势腐败菌主要是假单胞菌属细菌[2]，如荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。P. fluorescens是一种革兰氏阴性菌，是较典型的嗜冷菌，在冷藏水产品常见。P. fluorescens能产生脂肪酸酶，可导致水产品的脂肪氧化酸败和变质。此外，P.fluorescens也是水产养殖中常见的病原菌，常常粘附在鱼类体表形成生物被膜，通过生理代谢、基因表达和蛋白质表达的改变，以及降低代谢率和细胞分裂率来适应缺氧、营养或抗生素等环境限制[3,4]。

植物精油是芳香植物合成的次级代谢产物，主要由萜烯化合物、酸、醇、酯、醛、酮等芳香化合物成分组成。目前研究表明，植物精油具有广泛的抗菌和抗氧化特性，可通过提高细菌细胞内外渗透压差来破坏细胞壁和细胞质膜结构，从而进一步影响脂肪酸、多糖和磷脂双分子层的构象，实现抑制细菌生长繁殖、抑制细菌生物被膜和毒力因子形成等[5]。植物精油来源广泛，作为抗菌剂是目前抗菌材料研究的热点和发展趋势[6-7]。

乙醛（Acetaldehyde）是近年来研究较多的天然植物精油抗菌剂之一，研究人员已经证明己醛是一种抗菌化合物[8]。研究发现，己醛能够破坏细胞膜形成和线粒体功能并诱导黄曲霉等真菌凋亡[9]。除了抗菌特性外，乙醛还能阻断超氧化物歧化酶（SOD）的活性[10]。在适当浓度下乙醛具有青草味，对中国对虾的整体香气影响很小，不会改变虾肉的味道[11]。乙醛在抑制P. fluorescens的生长繁殖尤其是其生物被膜的形成方面的作用逐渐引起了研究者们的关注。例如，乙醛抑制白色念珠菌中酵母菌向菌丝的转化和生物被膜形成[12]。

大量的研究都表明了乙醛的良好抑菌性，但有关乙醛抑制P. fluorescens的机理研究尚少。因此，本实验首先通过测定乙醛的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，制定抑菌生长曲线，评价乙醛对P. fluorescens的抑菌能力；其次，通过P. fluorescens电导率、胞外总蛋白含量和胞内Na+K+-ATP酶活性的测定、生物被膜的观察和二乙酸荧光素染色实验，深入分析乙醛对P.fluorescens细胞膜完整性、生物被膜的影响，阐明乙醛对P. fluorescens的抑菌机理，为水产品保鲜技术研究及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

（1）菌种：荧光假单胞菌（P. fluorescens）来源于北纳创联生物科技有限公司，于28 ℃、150 r/min摇床中培养。

（2）试剂：乙醛（纯度 97%）购于上海麦克林生化科技有限公司；信号分子 C6-HSL来源于美国Sigma公司；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）购于青岛高科园海博生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）购于广东环凯微生物科技有限公司；ATP酶（Na+K+）测试盒购于齐一生物科技（上海）有限公司。

1.2 主要仪器设备

FA系列多功能电子天平，上海力辰仪器科技有限公司；XFS-40M电热式压力蒸汽灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司；BPMJ恒温恒湿培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2F超净台，苏州安泰空气技术有限公司；Agilent 8453紫外-可见光分光光度计，安捷伦科技有限公司；infinite M200 PRO酶标仪，广西南宁市博美生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

参考 Yang等[13]的方法略作修改，测定乙醛对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度。吸取培养至对数生长期（107CFU/mL）的荧光假单胞菌菌液100 μL加到96孔细胞培养板中，再将溶于50%乙醇的乙醛溶液加入到上述孔中，使乙醛的终浓度分别为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 和0.125 μL/mL。以等体积的乙醇（50%）为阴性对照，8 μL卡那霉素（浓度为20 μL/mL）为阳性对照。将96孔细胞培养板放在28 ℃恒温恒湿培养箱中培养24 h，并使用酶标仪测定OD595nm值。通过对OD595nm测定值比较，选择与阳性对照无明显差异的乙醛浓度作为乙醛对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度。

将96孔细胞培养板中清澈的菌液吸取100 μL用PBS稀释，菌悬液按0.5、1、2 μL/mL接种至无菌的TSA平板均匀涂布后置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h，以平板上无肉眼可见细菌生长的乙醛浓度为乙醛对荧光假单胞菌的最小杀抑菌浓度（MBC）。

1.3.2 生长曲线的测定

吸取100 μL培养至对数生长期（107CFU/mL）的荧光假单胞菌菌液于10 mL TSB培养基中，加入乙醛使其终浓度分别为1×MIC、2×MIC、4×MIC，以无菌去离子水作为空白对照。在 28 ℃生化培养箱中分别培养0、2、4、6、8、10、12 h，用酶标仪测定595 nm处的吸光值（A）。

1.3.3 乙醛对细菌细胞膜完整性的影响

根据卢群等[14]二乙酸荧光素（Fluorescein diacetate，FDA）染色方法略作修改。取培养至对数生长期的荧光假单胞菌菌液，离心去上清并用PBS重悬菌体，加入乙醛使其终浓度为 1×MIC、2×MIC、4×MIC，以无菌去离子水做空白对照，于摇床培养。分别取培养3、6、9、12 h的菌悬液各5 mL以8000×g离心10 min，去除上清液，留下的菌体用PBS重悬3次，离心后去除上清液，加入250 μL溶于丙酮的二乙酸荧光素（2 mg/mL），常温下静置15 min，PBS重悬洗涤三次，离心弃上清液PBS重悬。使用荧光分光光度测定平均荧光强度（激发波长为297 nm，发射波长为527 nm，激发狭缝与发射狭缝为5 nm）。

1.3.4 电导率分析

取过夜培养至对数生长期的荧光假单胞菌液，8000×g离心10 min，去除上清液，留菌体后用PBS重悬菌体，再以8000×g离心10 min，重复两次。最终菌体重悬于磷酸盐缓冲液，用酶标仪测定OD595nm值，调平其吸光度值。加入溶于乙醇的乙醛，使其终浓度分别为1×MIC、2×MIC、4×MIC，以无菌去离子水作为空白对照。于摇床中培养12 h，期间每2 h取样测电导率。

1.3.5 膜电位的测定

根据Zhang等[15]的荧光染色法（“罗丹明123”）适当修改。细菌的膜电位（MP）的大小可反映细胞的能量代谢活性，为了研究乙醛对荧光假单胞菌代谢活性变化的影响，将培养至对数期的菌悬液中分别加入1×MIC、2×MIC和4×MIC浓度的乙醛，以50%乙醇为空白对照，于28 ℃、150 r/min摇床培养3 h。离心后收集菌体，再用PBS洗涤2次后并溶解。将罗丹明123加入PBS中配置成1 mg/mL母液，加入菌液中使其终浓度为2 μg/mL，在黑暗中静置30 min后，将样品洗涤3次并重悬于PBS中，用荧光分光光度计测定平均荧光强度（激发波长为480 nm，发射波长为530 nm）。

1.3.6 乙醛对荧光假单胞菌细胞蛋白含量的影响

将P. fluorescens培养至对数生长期（107CFU/mL），吸取上清留下层菌体，加入PBS中重复离心，重悬洗涤两次，再加入乙醛使其终浓度为1×MIC、2×MIC，以无菌去离子水做空白对照，于摇床中28 ℃培养。分别取0、3、6、9、12 h的10 mL菌悬液离心去上清留菌体，加入PBS。用超声波细胞粉碎机在300 W功率下冰水浴中破碎菌体，每次超声时间为5 s，间隔3 s，重复三次并于4 ℃保存。采用总蛋白定量测定试剂盒中的 BCA法得到各组样品的蛋白浓度，并用紫外-可见光分光光度计于562 nm下测定其吸光度值。

1.3.7 乙醛对Na+K+-ATP 酶活力的影响

取培养至对数生长期（107CFU/mL）的荧光假单胞菌菌液，去除上清并于菌体中加入PBS，重悬两次后置于生理盐水中，加入终浓度分别为 1×MIC和2×MIC的乙醛，以无菌去离子水做空白对照，放在28 ℃摇床中培养12 h。期间分别取0、3、6、9、12 h菌悬液样品，离心去除上清液加入PBS重悬三次，用超声破碎仪破碎细胞。采用超微量Na+K+-ATP酶试剂盒测定荧光假单胞菌内Na+K+-ATP酶含量，用紫外-可见光分光光度计于636 nm下测定其吸光度。

1.3.8 乙醛对荧光假单胞菌生物被膜的影响

1.3.8.1 乙醛对荧光假单胞菌生物被膜形成量的影响

参考Lee等[16]的方法并稍加修改。将培养至对数期的荧光假单胞菌以体积比为1:1000接种于TSB肉汤，加入终浓度为0.016、0.031、0.062、0.125和0.25 μL/mL的乙醛，分别以体积分数50%的乙醇和信号分子C6-HSL为阴性和阳性对照。取200 μL混合菌液加入96孔板，放入28 ℃生化培养箱中静置培养48 h，然后取出菌液测定菌液密度（波长595 nm）；弃去菌液，用无菌水清洗96孔板3～5次，用无菌风干燥30 min，使生物被膜固定在96孔板内壁，同时取200 μL 0.1%（ρ）结晶紫对其染色15 min。弃去染色液，再用无菌水清洗3～5次至干净透明，用33%冰乙酸溶解残留的染色液。用酶标仪测定波长595 nm下溶解液的吸光度，每处理组取3个重复去平均值。生物被膜的相对形成量计算公式如下：

式中：

OD595nm——处理组指乙醛处理后测得的生物被膜；

OD595nm——阴性对照组指添加体积分数50%的乙醇后测得的生物被膜。

1.3.8.2 乙醛对荧光假单胞菌生物被膜的影响

参考Li等[17]的方法并稍加修改。将锌片用砂纸除去表面的氧化层，用剪到裁成10 mm×10 mm大小的正方形，置于无水乙醇和去离子水中先、后超声 30 min，烘干后灭菌备用。后续操作与酶标仪法测生物被膜形成量相同。培养后取出锌片用PBS冲洗去除浮游细菌，冲洗3～5次后置于4 ℃预冷的2.5%戊二醛溶液中浸泡4 h，再用50%、70%、90%乙醇进行梯度洗脱，100%无水乙醇脱水2次，乙酸异戊酯置换2次。干燥后进行喷金处理，利用扫描电子显微镜来观察生物被膜的形态。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 26.0进行数据方差分析，显著性水平p＜0.05。所有样品均进行3次重复，实验结果以“平均值±标准差”显示。

2 结果与讨论

2.1 乙醛对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）

采用微量稀释法测定不同浓度乙醛对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），评估其抑菌效果。如图1所示，不同浓度的乙醛对荧光假单胞菌均有抑制作用，并随着乙醛浓度增加，其抑菌作用增大。对培养至对数期的荧光假单胞菌采用0.5 μL/mL的乙醛处理后，菌液密度低于等体积的卡那霉素阳性对照，表明乙醛对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度为 0.5 μL/mL。此外，乙醛对荧光单胞菌的最小杀菌浓度为1 μL/mL。与Zhang等[18]研究的没食子酸对P. fluorescens的抗菌功效相比，乙醛对P.fluorescens具有较好的抑菌效果。

2.2 乙醛对荧光假单胞菌增殖速度的影响

乙醛对荧光假单胞菌增殖速度的影响可说明乙醛对荧光假单胞菌的抑菌能力。从图2荧光假单胞菌的增殖曲线可知，培养6 h后P. fluorescens达到对数生长后期，12 h后达到平台期。与空白对照相比，经过浓度分别为1×MIC、2×MIC、4×MIC的乙醛处理后，荧光假单胞菌的生长和繁殖均被显著抑制。何学文等[19]研究发现1×MIC和2×MIC浓度的肉桂醛在沙门氏菌生长前期增殖有抑制作用，随着培养时间增加，抑制作用降低；4×MIC浓度的肉桂醛能完全抑制沙门氏菌的增殖。可见，随着培养时间的增加，不同浓度的乙醛对荧光假单胞菌的抑菌能力与其它抑菌剂相比较稳定，至少在24 h内抑制荧光假单胞菌的增殖。

2.3 乙醛对荧光假单胞菌细胞膜结构完整性的影响

当荧光假单胞菌细胞膜被破坏时可引起荧光的泄漏，并引起二乙酸荧光素（FDA）的荧光强度降低，因此可以用 FDA的荧光强度来表征细胞膜完整性。图3显示，不同浓度乙醛处理3 h后，各组的荧光强度与空白对照相近，均为190 AU左右，无显著性差异（p＞0.05），表明此时细胞膜结构仍然保持完整。乙醛处理6 h、9 h或12 h，FDA荧光强度均有下降，其中4×MIC乙醛在12 h处理FDA降至81 AU，此时样品下降幅度最大，而不同处理时间空白对照组 FDA荧光强度几乎不变。由此可见，随着乙醛浓度的增加，处理时间延长，细胞膜结构受破坏程度越大，这与Wang等[20]的研究相符。

2.4 电导率的变化

细菌细胞膜的电导率的大小与细胞膜结构的完整性呈正相关关系。当细胞膜结构的完整性被破坏时，其通透性增加，可引起胞内K+、Na+、H+等离子经细胞膜外泄，进而影响细菌的正常的运动、代谢以及溶质转运等[21]生理活动。从图3可知乙醛处理后荧光假单胞菌细胞膜结构受损，因此，在此基础上结合电导率的测得，可以进一步分析乙醛对荧光假单胞菌细胞膜结构的影响。图4显示，不同浓度乙醛处理（8 h）内均导致荧光假单胞菌细胞膜电导率快速增大，且显著大于空白对照组；细胞膜电导率增幅随着乙醛浓度的增加而增大（4×MIC乙醛处理样品电导率增幅最大），表明乙醛可影响荧光假单胞菌的细胞膜通透性，引起胞内离子的外泄。乙醛处理8 h至12 h期间，各样品电导率变化均趋于平缓，可能与此阶段荧光假单胞菌的溶解与死亡有关。杨胜平等[22]研究牛至精油处理后P. fluorescens培养液电导率上升，细菌失去了原有的细胞形态，说明牛至精油处理破坏了P.fluorescens细胞膜完整性，使细胞内容物泄露，降低了P. fluorescens对细胞膜流动性的调控能力。

2.5 乙醛对荧光假单胞菌膜电位的影响

膜电位反映细菌细胞代谢活力，作为质子动力势的一部分参与腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的合成[23]。而细胞膜电位的变化可引起荧光光强度变化，因此，可以用荧光强度表征膜电位的变化。如图5所示，当乙醛浓度为1×MIC时，荧光假单胞菌菌液的平均荧光强度从空白对照的72 AU下降至35.57 AU，随着乙醛浓度增加，平均荧光强度进一步下降，浓度越大平均荧光强度下降程度越大。舒慧珍等[24]研究发现荧光假单胞菌的膜电位下降后,促使细胞代谢失常和去极化。由此可见，乙醛处理降低了荧光假单胞菌的膜电位，可能降低细菌的代谢活力。

2.6 乙醛对荧光假单胞菌细胞蛋白含量的影响

蛋白质是生命的重要基础，蛋白质的变化可直接影响细胞的生物活性[25]。如图6所示，与空白对照组蛋白质含量则随着时间延长而缓慢增加的趋势不同，不同浓度的乙醛处理（1×MIC、2×MIC和4×MIC）3 h内均导致胞内蛋白质的含量迅速下降，分别下降至0.40、0.35和0.34 mg/mL；乙醛处理3～12 h期间蛋白质含量变化呈现平缓、略有下降，其中1×MIC处理后蛋白含量为0.31 mg/mL，2×MIC和4×MIC处理组的蛋白质含量变化趋势基本一致。荧光假单胞菌细胞蛋白质的变化与细胞能量代谢等重要生命活动密切相关，乙醛处理可降低荧光假单胞菌细胞蛋白质的含量，影响蛋白质的代谢。Shen等[26]研究表明肉桂醛会破坏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞内蛋白质的合成，从而影响细胞的生长与代谢，影响了细胞膜的完整性，与本研究结果相同。

2.7 乙醛对荧光假单胞菌内 Na+K+-ATP酶活力的影响

腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的合成和分解代谢是细胞维持稳态的重要机制，而Na+K+-ATP酶作为一种位于细胞质膜磷脂双分子层中的蛋白酶，它参与了为细胞代谢直接提供能量的ATP的水解催化过程，在细胞物质运输、能量转化、膜电位调节及信息传递等方面均具有重要作用[27,28]。如图7所示，空白对照组样品在培养时间内胞内 Na+K+-ATP酶活力呈现先增强后减弱的趋势，其中活力增强可能是由于前6 h内荧光假单胞菌增殖的结果；而1×MIC、2×MIC乙醛处理6 h菌内ATP酶活力降至31.36和28.12 U/mg，随着培养时间延长Na+K+-ATP酶的活力逐渐下降，12 h降至26.33和22.17 U/mg。Zhang等[29]研究了迷迭香酸会显著降低大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌胞内三磷酸腺苷的释放。因此，可推测乙醛降低Na+K+-ATP酶活性后胞内ATP代谢异常，不能正常为细胞活动供给能量，导致荧光假单胞菌的凋亡。

2.8 乙醛对荧光假单胞菌生物被膜的影响

2.8.1 乙醛对荧光假单胞菌生物被膜形成率的影响

如图8所示，当乙醛浓度为0.016 μL/mL时，其荧光假单胞菌生物被膜相对形成率为91.20%；而当乙醛浓度为0.25 μL/mL时，其生物被膜相对形成率下降至30.11%；与未加处理对照组相比，不同浓度的乙醛均能抑制荧光假单胞菌生物被膜的形成；而添加外源C6-HSL信号分子可促进该菌生物被膜的形成。信号分子是细菌生物被膜形成的关键影响因素，这提示我们，乙醛有可能通过对信号分子的干扰，进而抑制生物被膜的形成，与 Ahmad等[30]的研究结果相符合。Topa等[31]研究表明亚抑菌浓度肉桂醛对铜绿假单胞菌的生长不产生影响，破坏了铜绿假单胞菌种间信息交流过程中预先形成的生物被膜；当肉桂醛的浓度为0.5×MIC时，生物被膜的形成率仅为24.40%，抑制率达到 75.60%。因此，可以推测乙醛可以影响P.fluorescens生物被膜的结构，对细菌的扩散式增殖进行抑制。

2.8.2 乙醛对荧光假单胞菌生物被膜的影响

生物被膜的功能与其结构密不可分，通过干扰荧光假单胞菌的聚集能减少细菌增殖[32]。本研究利用扫描电子显微镜观察乙醛处理对P. fluorescens生物被膜结构的影响。由图9a显示，相比于阴性对照组，添加信号分子C6-HSL后锌片表面形成的生物被膜浓厚且致密，这表明P. fluorescens生物被膜的形成可能受到信号分子的调控。图9c～9f经过不同乙醛浓度处理，细菌数量随着乙醛浓度的增加而显著减少，且菌体呈现出无规则排列分布状态，无法形成聚集的细菌团簇，而且粘附在锌片表面的细菌数量也明显减少，与王硕等[33]的研究结果相符合。綦国红等[34]研究发现肉桂醛在低于MIC浓度下，通过光学显微镜进行观察发现铜绿假单胞菌生物被膜的形成具有抑制作用。因此，推测乙醛可能通过干扰荧光假单胞菌的聚集来减少生物被膜的形成。

3 结论

本文深入研究乙醛对荧光假单胞菌的抑菌活性及机理，验证了乙醛在亚抑菌浓度下是具有抑制生物被膜特性。研究发现，乙醛对荧光假单胞菌的生长于繁殖具有较强的抑制作用，在24 h内抑制荧光假单胞菌的增殖。乙醛可通过破坏荧光假单胞菌细胞膜的完整性，增加膜的通透性和电导率，降低胞内蛋白质含量和抑制ATP分解代谢相关酶活性，全面破坏荧光假单胞菌的生命物质基础、正常生理活动及能量代谢。此外，乙醛能够在低于1×MIC浓度下有效抑制荧光假单胞菌生物被膜形成过程及形态，可能与荧光假单胞菌分泌的群体感应信号分子有关，具体机理有待进一步通过转录组学、分子对接等手段研究探明。