宫颈上皮内瘤变及鳞癌中人乳头瘤病毒不同亚型分布及多重感染的研究

陈婷婷，张 燕，程会贤，陈名园，王 巍

(四川大学华西第二医院病理科、出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室，四川 成都，610044)

宫颈癌是全球女性的第四大常见癌症类型[1]，在中国仅次于乳腺癌，为女性第二大常见癌症类型。在15～44岁女性各系统癌症发病率中居第二位，死亡率居第三位，且近年来呈年轻化趋势[2]。高危型人乳头瘤病毒( human papilloma virus，HPV)持续感染是公认的导致宫颈上皮内瘤变(cervical epithelial neoplasia，CIN)及宫颈癌的主要致病因素。作为目前唯一病因明确的癌症，宫颈癌是可以通过早期筛查、早期发现、彻底防治的[3]。但目前全球宫颈癌防控形势仍然非常严峻，特别是在中低收入国家。目前，越来越多的国家开始使用HPV基因分型进行宫颈癌初筛。不同HPV亚型拥有不同的致癌能力，了解不同亚型在宫颈病变中的分布及多重感染情况对宫颈癌的预防、疫苗应用及筛查策略制定，均有着重要意义。本研究选取四川大学华西第二医院病理科诊断为CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌的四川地区病例，运用返向点杂交法检查其HPV感染情况，统计不同亚型HPV在CIN及宫颈癌中的分布及多重感染情况，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年7月至2020年6月四川大学华西第二医院病理科诊断为CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌的四川地区病例384例，其中CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ分别为77、50、166例，宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma，SCC)91例。均符合WHO2020版《女性生殖道病理学》诊断标准，并为经组织病理诊断明确的四川地区病例。排除资料不全病例。

1.2 方法

1.2.1 组织学检查所有病例组织学结果均经2名高级职称病理医师复查，结果分为低级别上皮内瘤变CINⅠ、高级别上皮内瘤变CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌四组，同时具有多种病变者，以最严重病变归入相应组。

1.2.2 HPV亚型检测①仪器与试剂：基因扩增仪ETC-811购自于苏州东胜兴业科学仪器有限公司，全自动核酸分子杂交仪YN-H48和人乳头瘤病毒基因分型(23型)检测试剂盒(PCR-返向点杂交法)均购自于亚能生物科技(深圳)有限公司。②实验步骤：采用HPV基因分型检测试剂盒(亚能生物)进行HPV检测，经过样本HPV DNA的提取，PCR扩增，杂交，洗膜，显色，对所有病例进行23种HPV亚型检测，包括17种高危型HPV(HPV16、18、 31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82) 和6种低危型HPV( HPV6、11、42、43、81、83)。③结果判断(参照产品说明书)：仅一个基因型位点出现蓝色斑点，则为相应基因型的单一感染；多个基因型位点出现蓝色斑点，则为相应基因型的混合多重感染。

1.3 统计学方法采用SPSS 24.0进行统计学处理。计数资料的组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组病变年龄及HPV感染率所有患者(384例)平均年龄(43.45±10.73)岁，各组病变平均年龄逐渐增大。384例患者总的HPV感染率为95.80%，其中高危型感染率95.05%，低危型感染率7.81%。各组病变均以高危型HPV感染为主，且高危型HPV感染率与总体HPV感染率比较，差异无统计学意义，见表1。

2.2 HPV亚型分布情况368例感染病例中，共检出病毒493株，23种亚型均有检出。低危型HPV感染占比(6.29%)远低于高危型占比(93.71%)。CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ及宫颈癌中高危型感染占比逐渐升高，而低危型HPV感染占比逐渐降低，趋势检验结果说明低、高危型的病毒感染与病变程度之间存在线性变化(Z=9.085，P=0.003)。不同宫颈病变组别间低危型和高危型HPV感染构成比差异有统计学意义(P=0.028)，以高危型HPV感染为主。见表2。

表1 宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中各组病变年龄及HPV感染情况

表2 宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中低危型和高危型HPV分布情况[株(%)]

总体病例中最常见的HPV类型为16、58、52、33、18型；其中CINⅠ中最常见感染类型为HPV52、58、56、51、68、16及6型；CINⅡ中最常见的为HPV52、16、58及51型；CINⅢ中最常见的为HPV16、58、33、52及31型；宫颈癌中最常见的为HPV16、18、58、33及52型。HPV16型在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌中感染率逐渐增高(从9.09%到71.43%)。此外，HPV16、18、58、52、33五种亚型在宫颈癌中感染率高达96.70%，其中16型71.43%，18型7.69%，而52、58、33三种类型为17.58%。见表3。

表3 宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中不同HPV亚型分布情况 [n(%)]

2.3 HPV多重感染情况368例感染病例中单一亚型感染274例(74.46%)，多重感染94例(25.54%)。在多重感染中，双重感染69例(18.75%)，三重及以上感染25例(6.79%)；低危+高危感染27例(7.34%)，多重高危感染67例(18.20%)。HPV多重感染在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌中占比分别为50.00%、30.61%、21.25%、10.34%。统计结果显示，不同宫颈病变组间单一亚型、多重感染构成比差异有统计学意义(P=0.001)，以单一亚型HPV感染为主。见表4。

表4 宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中HPV单一亚型感染和多重感染情况

3 讨论

3.1 各级CIN的发病年龄及HPV感染情况HPV是一种双链DNA、无包膜病毒，定向感染皮肤及黏膜的复层鳞状上皮细胞[3]。高危型HPV持续感染是引起宫颈癌的主要因素，几乎所有的宫颈鳞状细胞癌都与HPV感染相关。既往观点认为，HPV感染导致CIN病变是一个缓慢、渐进和连续的过程，低级别CIN(CINI)发展到高级别CIN(CINⅡ和CINⅢ)直至恶变为宫颈癌需要数年至数十年时间[3, 4]。在本研究中我们发现，患者年龄是随着病变严重程度增加而增高的，从CINⅠ发展到CINⅢ直至宫颈癌大致需要十年时间，这与既往文献报道基本一致。但是，我们也发现部分年轻CIN患者没有低级别CIN病变，而发病直接就是高级别CIN病变。这一发现也在Bedell等的文献中得到了证实[5]，该文献还指出不是所有的高级别CIN都是由低级别CIN发展而来，CINⅠ可能不是CINⅢ发展的必要条件，有些CINⅢ可以直接从HPV感染的正常上皮细胞进化而来。这种发病机制可能与我们已知的HPV致癌机制不同，可能是由某些基因的甲基化程度所决定，导致的病变不是由量变到质变的线性发展，而是类似“分子开关”模型(全或无)，进展为宫颈癌所需时间也更短。

3.2 宫颈各级CIN病变中HPV各基因亚型分布情况HPV各基因亚型的分布和频率在不同地区及不同病变中均存在差异。一项集中全世界各国一万多例宫颈癌患者荟萃分析研究发现，全球范围内最常见的基因型是HPV16型，第二位为HPV18型，其他基因型如HPV58、52型在亚洲较多[6]。本研究结果与以上结论相符，宫颈癌中最常见的HPV基因型为16、18、58、33、52。此五种高危型HPV在宫颈癌中感染率高达96.70%，其中16、18型高达79.12%，而52、58、33三个亚型占比也达17.58%。各病变组中常见HPV感染亚型均不完全相同且存在变化，且有别于国内其他地区HPV分布研究。刘键等[7]深圳地区研究中常见HPV类型为16、18、58、31、33；张勤等[8]重庆地区研究中常见HPV类型为16、18、33、52、58；而本研究中常见HPV类型为16、58、52、33、18。相似之处为16型最常见，52、58、33型也均较常见，不同之处为四川地区18型阳性比率低于前两研究。其原因除了地域差异外，研究对象的纳入标准不同也会导致结果不同。冯余宽等[9]四川地区常见HPV类型为58、16、56、18。范永霞等[10]成都地区常见HPV类型为52、16、53、58、51。其结果不同于本研究是由于前者纳入了大量宫颈炎病变患者，而后者是分析的液基细胞样本。四川地区HPV感染有一定地域性特点，但也要考虑其他研究因素对结果的影响(比如其他研究的对象可能是妇科门诊患者或者包含宫颈炎患者，而我们的研究对象是CIN及宫颈癌患者)。HPV基因亚型在不同宫颈病变中的分布和频率存在变化规律，高危型HPV(主要是16亚型)感染率在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌中逐渐升高。2015年美国阴道镜和宫颈病理学会(ASCCP)发布并执行了FDA批准的HPV检测用于宫颈癌初步筛查的临时指南[5]，并将HPV16、18作为筛查分流的依据。相比细胞学筛查，HPV筛查结果更客观且有更高的阴性预测值。但我国HPV感染除常见的16、18型外，58、52、33阳性占比也较高，且均可单独导致宫颈癌的发生[6, 9]。由此可以推测，在我国四川地区，四价疫苗和九价疫苗的有效保护率会高于文献报道[11]的70%和90%。在没有接种九价HPV疫苗患者中，除16、18型外，58、52、33型感染更值得关注。

3.3 HPV多重感染情况现有的大量研究均表明，患者的年龄、性行为、伴侣人数、环境条件、吸烟等多种因素是导致HPV感染的主要原因，而上述一些因素如拥有不同的性伴侣则可导致多重感染的发生[9, 12, 13]。而多重感染各亚型HPV是否存在相互作用，尤其是高危型HPV多重感染对宫颈CIN病变以及宫颈癌的发生是否会有协同作用这一问题则鲜见有研究。为了探索HPV多重感染尤其是高危型HPV多重感染是否会加重CIN病变、是否会比单一亚型感染更加容易致癌，本文对各级别CIN及宫颈癌的多重HPV感染情况进行了研究。可以发现，CINⅠ、CINⅡ、CIN Ⅲ及宫颈癌中多重感染率从50.00%到10.34%明显是逐渐减低的。这一结果至少说明了两点： ①HPV多重感染率没有随着病变严重程度增加而增高，相反是降低的，因此可以认为HPV多重感染对病变的发展并没有协同促进作用；②从多重感染的亚型分布来看，随着病变加重、HPV多重感染率下降，渐少的亚型主要是低危型HPV，而高危型HPV也有不同程度的减少，由此可见绝大多数HPV感染是一过性的。对于第一点，Chaturvedi等[14]也通过对5871名性活跃妇女HPV感染情况研究发现，多重感染患宫颈癌风险与单一感染总体相似，几乎没有多重感染的HPV之间存在协同相互作用的证据，多重感染中的HPV是随机发生并独立导致宫颈疾病。VanHoof等[15]通过激光捕获显微切割-HPV PCR基因分型(LCM-PCR)技术，从CIN和正常上皮切片中的各个不同病变区域的上皮细胞中准确地检测出特定类型的HPV DNA。通过LCM-PCR发现，在93%的病变区域中每一种HPV类型均只与一种独立的CIN病变相关，而在7%多重感染病变区域中，也大部分是由两个独立的CIN病变碰撞产生。由此作者也总结出，一种HPV感染一个独立的宫颈上皮区域，引起一种独立的病变(CINⅠ、CINⅡ或CINⅢ)。对于第二点，其原因一方面可能是低危型HPV DNA在感染中多以游离形式存在，宿主免疫系统可将其清除；而高危型HPV DNA最初也以游离形成存在，但随着持续性感染，病毒可将其部分DNA片段(包括E6/E7 DNA)整合入宿主DNA，导致原癌基因被激活。到这个时候宿主免疫系统就无法将其完全清除，进而进展为高级别上皮内瘤变及宫颈癌[3, 16, 17]。而另一方面正如VanHoof等的研究结果提示，一种HPV感染引起一种独立的病变，病变独立且具有排它性即HPV间可能存在竞争性抑制效应[15]。当然，这还需要更多的科学研究来证实。综上所述，结合近来最新的研究和我们的临床研究结果，我们认为HPV多重感染并未增加癌的风险，当然不同HPV亚型感染之间的相互关系与作用，值得我们深入研究。