基于Rho/ROCK通路观察盐酸小檗碱干预心肌肥厚作用机制研究

寇涂利 ，尹立雪,，罗浩柔 ，沈 阳

(1.西南医科大学临床医学院,四川 泸州 646000；2.四川省医学科学院.四川省人民医院心血管超声及心功能科,四川 成都 610072；3.成都市第七人民医院,四川 成都 610000)

心肌肥厚作为一种心脏超负荷的代偿性反应，和许多心血管疾病的发生发展密切相关[1]，心肌肥厚最初是维持正常血液循环的代偿机制，但持续的肥厚不仅能刺激胶原合成，促进间质纤维化，并且还能诱导基质金属蛋白酶(MMPs)活化，从而降解胶原，最终会导致充血性心力衰竭和猝死[2]。心肌肥厚是导致心力衰竭和猝死的主要原因之一，因此，阻断心肌肥厚是防治心脏重构、改善心肌功能的关键环节[3]。有研究表明，某些植物化学物质可以通过调节信号传导通路从而抑制病理性心肌肥厚，主要包括蛋白激酶C(PKC)通路、钙调神经磷酸酶(CaN)通路和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路等[4]。作为被广泛研究的中草药，盐酸小檗碱已被证明具有多种药理作用，如免疫调节、抗炎、抗肿瘤、降血脂等[5]。有研究称其能有效抑制病理性肥厚，然而其作用机制尚不明确[6]。本研究于2021年4～9月采用异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚模型，拟观察盐酸小檗碱对Rho/ROCK信号通路的影响及其抗心肌肥厚的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物雄性SD大鼠(230～270克)，SPF级，购于成都达硕实验动物公司(SCXK 2020-030)。大鼠在恒温条件下适应性喂养一周，自由饮食和饮水。本工作获得四川省人民医院伦理委员会批准。

1.2 试剂及器材ISO(货号：HY-B0468)、苏木素染液(批号：ZH193907)均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。伊红染液(批号：C200403)购自珠海贝索生物技术有限公司。改良Masson三色染色液(批号：0227A21)购自合肥博美生物科技有限责任公司。ROCK(批号：AF7016)、 RchoA(批号：AF6352)、PTEN(批号:AB31392)，均购自北京博奥森生物技术有限公司。TGFβ1(批号:BS-20411R)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。生物素二抗：山羊抗兔工作液(批号：SP-9001)，购自北京中杉金桥生物有限公司。心脏超声仪器(Vivid E9)美国GE公司。图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)。

1.3 方法

1.3.1实验动物与分组 将40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、较低剂量干预组、较高剂量干预组，每组10只。大鼠适应性喂养一周后，除了正常组对照以外，其余组大鼠予以腹腔注射3 mg/kg异丙肾上腺素建立心肌肥厚模型，正常对照组给予等量生理盐水7天。建模后12小时，分别予以较低剂量干预组、较高剂量干预组大鼠5、10 mg/kg盐酸小檗碱灌胃，其余两组给予等量生理盐水灌胃，连续2周。

1.3.2超声数据采集 所有大鼠的超声图像在基线时、成功建模后和给药后2周后收集。将大鼠置于左侧卧位并固定在检查床上，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠。连接同步肢体导联心电图获得超声参数。使用12 S(12 MHz)相控阵儿科换能器,频率为10 MHz，深度为2 cm，帧率为每秒220帧。在乳头肌水平获得的标准二维短轴图像被数字化存储。记录舒张末期心室间隔(IVS)厚度、左心室后壁厚度(LVPW)，所有参数测量3次，取平均值。

1.3.3病理学观察 图像采集后，每组分别随机处死3只大鼠。左心室心肌用10%多聚甲醛固定，切片用苏木精和伊红染色，观察心肌细胞的形态和坏死程度；Masson三色染色观察心肌纤维化程度。每个切片随机选取5个视野，在光学显微镜下观察拍照。

1.3.4各组大鼠心肌组织Rho/ROCK信号通路因子表达量 采用免疫组织化学SP法检测 RhoA、ROCK、TGF-β1、P-PTEN蛋白表达情况。 固定标本、包埋、切片，使用二甲苯脱蜡、梯度酒精水化以及3%甲醇双氧水灭活后行抗原修复。 一抗4 ℃孵育12 h后滴加二抗,然后使用DAB显色试剂盒，混匀试剂后滴加到切片上，室温显色。用显微镜对切片进行图像采集,采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定所采集全部图像的光密度(integrated optical density，IOD)和面积，并计算每张图像的平均光密度(Mean density，MD)，以平均来评价蛋白表达情况。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据用均数±标准差表示。四组大鼠建模前后、干预前后采用配对样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况实验中，正常对照组大鼠未见明显异常；在建立给予腹腔注射异丙肾上腺素期间，模型组大鼠、较低剂量干预组、较高剂量干预组分别猝死2只、1只、1只，最终总共36只大鼠被纳入统计分析。

2.2 常规超声数据四组大鼠基线IVS、LVPW值比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。在整个实验过程中，正常对照组大鼠的IVS、LVPW值无明显变化(P>0.05)。其余组大鼠的IVS、LVPW值在模型建立后显著增加(均P< 0.05)。在相应干预后，较高剂量组大鼠的IVS值、LVPW值较前降低(P<0.05)，较低剂量组变化无统计学意义，且较高剂量组低于较低剂量组和模型组。见表1。

表1 四组大鼠基线、建模成功及干预2周后IVS、LVPW值比较 (mm)

2.3 病理结果正常对照组大鼠心肌组织结构完整清晰，心肌纤维形态正常。而模型组大鼠心肌细胞显著增大，炎性细胞浸润，心肌纤维化加重。与模型组相比，干预组大鼠上述心肌病理均有所缓解，结构更完整，以较高剂量组明显。马松染色可见，与正常对照组相比，其余三组均出现不同程度的心肌纤维化，纤维组织明显增生；与模型组相比，干预组大鼠心肌纤维化程度均有所减轻；与较低剂量组相比，较高剂量组心肌纤维化程度进一步减轻。盐酸小檗碱能在一定程度上减轻异丙肾上腺素诱导的胶原纤维增生。

2.4 大鼠心肌组织 Rho/ROCK信号通路蛋白量比较与正常对照组相比，其余三组大鼠RhoA、ROCK、TGF-β1蛋白表达量升高，P-PTEN蛋白表达量均有所降低(均P<0.05)。此外，与模型组相比，较低剂量组和较高剂量组大鼠RhoA、ROCK、TGF-β1蛋白表达量均有所降低，P-PTEN蛋白表达量均有所升高(均P<0.05)；与较低剂量组相比，较高剂量组RhoA、ROCK、TGF-β1蛋白表达量进一步降低，P-PTEN蛋白表达量进一步升高(均P<0.05)。见表2、图1。

表2 四组大鼠心肌组织Rho/ROCK通路蛋白量

图1 四组大鼠心肌组织P-PTEN、TGF-β1、ROCK 、RhoA免疫染色结果 (×200)

3 讨论

心力衰竭是一种全球性流行病，全世界估计有2600万人受到影响，也正在成为亚洲最常见的心脏病之一，5年和10年死亡率分别为50%和90%[7]。心肌肥厚是心力衰竭的最主要形式，病理性心肌肥厚可由高血压、心肌梗死和瓣膜性心脏病引起[8]。心脏的压力或容量超负荷(例如，由于高血压或瓣膜紊乱)可诱导心肌肥大，这最初是一种代偿性反应，但持续的超负荷最终会导致充血性心力衰竭、心律失常和猝死[2]。此外，氧化应激、能量代谢紊乱、血流动力学因素、神经体液因子、心血管自分泌/旁分泌因子、胰岛素抵抗、microRNA和遗传学等多层次复杂因素参与了心肌肥厚的发生发展。尽管心肌肥厚的确切分子机制仍不完全清楚，但在心脏疾病的早期阶段提供正确的治疗可能会诱导左心室恢复其正常的功能和结构[9]。因此，寻找新的化合物延缓或逆转心肌肥厚是很重要、迫切的。

小檗碱是一种异喹啉生物碱，广泛存在于小檗科、罂粟科、猫爪草、茜草科、半月板花属植物中，是中药的组成部分，具有多种药理作用。它最初被用于治疗肠道炎症，因为它具有显著的抗微生物活性和抗炎、抗增殖、抗纤维化等特性[10]。小檗碱已成为治疗心血管、内分泌和肠道疾病的有效药物[11]。有研究表明，植物化学物质可以通过调节信号传导通路从而抑制病理性心肌肥厚，主要包括PKC通路、CaN通路和MAPK通路等[12]。在近期的报道中称盐酸小檗碱可有效抑制心肌肥厚[6]，然而其作用机制尚不明确。

大鼠的心脏通常被用作人类健康和疾病状态下的心脏实验模型[13]，β-肾上腺素受体的持续激活可诱导病理性心肌肥厚、心肌纤维化和心肌缺血。ISO是一种强大的合成非选择性β-肾上腺素受体激动剂，已被广泛用于心肌肥厚模型[14]。本研究中，给予大鼠腹腔注射3 mg/kg的异丙肾上腺素7天后，可观察到心肌IVS、LVPW厚度均明显升高，且在病理下可以观察到大鼠心肌细胞形态不规则、心肌细胞显著增大，炎性细胞浸润，成纤维细胞增生明显，显示在研究中ISO诱导了典型的心肌肥厚模型。

心力衰竭是最常见的心血管疾病且是大部分心血管疾病的终末阶段，在细胞水平上，心肌肥厚的特征是细胞增大和胎儿基因程序的重新激活，以及细胞骨架的重组[15]。心肌肥厚作为心力衰竭的生物学基础受多种信号通道调控，如Akt、 P13K、MAPK、AMPK、GPCRs等信号通路，大多数学者认为通过调控相关信号通路可以调控整个心肌肥厚过程达到改善或逆转心肌肥厚的目的，继而治疗心力衰竭[16]。Rho/Rock信号通路是体内重要的信号转导通路，RhoA是Rho蛋白家族的主要成员，而Rho激酶(ROCK)为Rho下游靶效应分子，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[17]，能接受Rho传递的信号，激活ROCK能使多个氨基酸位点发生磷酸化，并介导下游一系列的磷酸化与脱磷酸化反应，产生多种细胞学效应[18]。有研究发现异常高表达的Rho会引起心肌肥厚、心室重塑、心肌功能下降及心力衰竭[19]。肿瘤抑制因子P-PTEN在心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞广泛表达，与细胞的生长、分化、凋亡调控有关，PTEN能调节心肌细胞肥大及存活，越来越多的研究证实，心肌细胞中PTEN的特异性失活导致心肌肥厚，有报道称敲除PTEN基因可致心肌肥厚，并减低心肌的收缩性[20，21]。在本研究中我们可以观察到由异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚大鼠，其IVS和LVPW均明显增厚，且心肌组织中RhoA和ROCK的表达量明显高于正常对照组大鼠，说明Rho/ROCK信号转导通路参与心肌肥厚肥厚过程，而使用较高剂量盐酸小檗碱干预后，可以发现心肌IVS、LVPW厚度减轻，在较低剂量组中也呈现降低趋势，这时心肌组织中RhoA和ROCK的表达量均有所降低，说明盐酸小檗碱可能通过抑制Rho/ROCK信号转导通路从而改善心肌肥厚，且在抑制该通路上可能存在剂量依赖性。

心脏纤维化是许多心血管疾病常见病理特征，并且是参与心血管疾病恶化过程的重要因素[22]。Rho/Rock信号转导通路能够调控细胞增殖，参与组织损伤修复和再生，在心肌纤维化过程中发挥着重要作用[17]。转化生长因子TGF-β1是目前能诱导成纤维细胞增殖和胶原合成最为明显的细胞因子之一[23],TGF-β1已被证实是Rho/ROCK信号通路的上游激活因素，而ROCK又可以诱导心肌细胞大量释放TGF-β1促进纤维化[19]。在病理观察下可以发现到由异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚大鼠均出现不同程度的心肌纤维化，其TGF-β1表达均有所升高，而在使用盐酸小檗碱干预后的大鼠心肌组织中，心肌纤维化程度减轻，TGF-β1表达均有所降低，提示盐酸小檗碱可以通过抑制Rho/ROCK信号通路、降低TGF-β1表达从而减轻心肌纤维化，减少细胞外基质的分泌。这也与陈志冬等[24]的发现相一致。本研究结果也说明了TGF-β1参与心肌肥厚和左心室纤维化，这也和既往的研究相符[25]。

综上所述，本研究提示盐酸小檗碱能改善心肌肥厚，抑制心肌纤维化，其机制可能与是抑制Rho/ROCK通路、调整TGF-β1、P-PTEN表达量有关。