大补阴丸治疗2型糖尿病合并骨关节炎的实验研究

吴鑫宇，关子赫，张婷婷，周雪明

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

2型糖尿病合并骨关节炎是一种特殊类型骨关节炎，由于2型糖尿病患者血糖异常升高，机体会出现一系列炎症表现，伴随关节软骨的退行性病变[1]。同时，骨关节炎会严重影响患者的运动生活能力，长期低运动量摄入体内糖分无法通过能量消耗的渠道分解，患者对血糖的调控能力明显减弱。2型糖尿病与骨关节炎互为因果恶性循环[2]，治疗难度大，引起了广大学者及医务工作者重视。

临床常用的2型糖尿病西医用药治疗方案主要为降糖药和胰岛素治疗[3]，骨关节炎西医治疗方案主要有消炎止痛、营养软骨以及关节腔内注射药物。然而针对2型糖尿病合并骨关节炎目前西医并没有公认推荐的治疗方案[4]。临床中治疗该病可采取中医药进行干预，并收到了良好的疗效[5]，大补阴丸作为治阴虚火旺的主方，临床中可用以治疗2型糖尿病合并骨关节炎，但目前尚缺少作用机理的实验数据支持。本实验采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)配合化学损伤法获得2型糖尿病合并骨关节炎大鼠模型。以二甲双胍作为阳性对照药，二甲双胍是一线口服降糖药，广泛应用于2型糖尿病临床治疗中[6]，二甲双胍能够降低软骨细胞增殖分化活性，有治疗骨关节炎的作用[7]。以大补阴丸为实验药物，大补阴丸可滋肾阴，降相火，从肾论治本病，以减轻患者临床症状。比较用药前后大鼠随机血糖、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及转化生长因子-β1(TGF-β1)的变化，为大补阴丸治疗2型糖尿病合并骨关节炎的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠50只，体质量(200±20)g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK(黑)2013-012，饲养于黑龙江中医药大学基础医学院中药学实验室，环境湿度(45±5)%，温度(23±2)℃，在实验前普通饲料适应性喂养1周，给予大鼠12 h昼夜交替照明，自由摄食及饮水。

1.2 药物及制备

大补阴丸中药物购自黑龙江中医药大学附属第一医院，大补阴丸由熟地黄18 g，炙龟板18 g，黄柏12 g，知母12 g组成，上述生药加6倍量水浸泡2 h，炙龟板先煎20 min，再纳入其余药物，武火加热煮沸后，文火煎煮30 min，用纱布滤出药液，药渣再加3倍水，煎煮30 min，过滤，2次药液合并，浓缩得到所需浓度的水煎剂，置于4 ℃冰箱中保存待用。高脂高糖饲料制备：猪油、鸡蛋黄粉、胆固醇、胆酸盐及基础饲料，分别按15%、10%、2%、0.4%、72.6%的配比制得高脂高糖饲料。盐酸二甲双胍片(万全万特制药有限公司，国药准字H35020664)，以蒸馏水溶解盐酸二甲双胍片并配制成所需浓度，置于4 ℃冰箱中保存待用。

1.3 主要试剂及仪器

罗氏血糖仪、血糖试纸(批号：07124112，罗氏)；全自动生化分析仪(7180)；显微摄影成像系统(moticam 3000)；德国莱卡切片机(LEICARM 2135)；链脲佐菌(购于美国Sigma公司)；单碘乙酸(上海源叶生物科技有限公司)；基质金属蛋白酶-3(MMP-3)(Bioss公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模、分组及给药

将50只大鼠随机分为5组，每组10只，分别为空白组、模型组、阳性药组(二甲双胍)、大补阴丸高剂量组及大补阴丸低剂量组。空白组大鼠腹腔注射生理盐水70 mg/kg，以普通饲料喂养。其余各组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)70 mg/kg，以高脂高糖饲料喂养3 d，空腹8 h，尾静脉采血，连续采血2 d，随机血糖均≥11.1 mmol/L视为2型糖尿病模型成功。采用化学损伤法造关节炎模型[8]，配制40 mg/mL单碘乙酸溶液，弯曲大鼠左膝关节，使关节间隙充分显露，除空白组外其余各组大鼠关节内注射50 μL单碘乙酸溶液诱导骨关节炎，空白组大鼠左膝关节注射等量生理盐水。造模成功后，于次日进行给药，其中空白组和模型组给予生理盐水灌胃，依据人-大鼠体表面积公式折算，阳性药大鼠给药量为0.14 g/(kg·d)，大补阴丸成人每日服药量作为大鼠低剂量，大补阴丸低剂量组大鼠给药量为1.62 g/(kg·d)，高剂量给药量为低剂量的2倍，大补阴丸高剂量组大鼠给药量为3.24 g/(kg·d)。每日上午灌胃1次，连续灌胃6周。

1.4.2 样本采集

分别于用药前及药物治疗2周、4周及6周后采血。末次给药24 h后，用10%的水合氯醛于大鼠腹腔内注射给药麻醉，注射剂量为4 mL/kg，颈总动脉取血，于4 ℃静置1 h后，3 000 r/min离心15 min，取上层血清，-20 ℃保存，以备血清学检测。每只大鼠左膝关节腔内注入生理盐水500 μL，将生理盐水与关节液混匀，然后再抽取关节液，3 000 r/min离心10 min，取上清液，置于-20 ℃待检测，剥离大鼠左膝关节置于4%多聚甲醛内固定。

1.4.3 血糖仪检测大鼠血糖

大鼠尾静脉取血，用血糖仪分别检测第0周、第2周、第4周及第6周随机血糖值。

1.4.4 免疫组化检测大鼠骨关节中MMP-3含量

将已固定的关节标本取出，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋待用。进行免疫组化两步法，常规脱水透明，中性树胶封片、切片，显微镜下观察。

1.4.5 qRT-PCR检测大鼠关节液中IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表达水平

以Trizol法提取总RNA，然后按照逆转录试剂盒说明书进行操作。以qRT-PCR技术检测IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表达水平情况。反应结束后，得出CT值，并计算基因相对表达量。引物序列信息如表1。

表1 PCR引物序列

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠治疗前后血糖数值

空白组大鼠血糖数值在正常值范围，整个实验过程血糖基本保持稳定，其余各组大鼠第0周随机血糖数值符合糖尿病大鼠标准(≥11.1 mmol/L)，此动物模型可靠。空白组与其余各组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。各给药组自第2周起与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。随着给药过程持续进行，各给药组大鼠血糖均趋于或恢复正常数值,见表2。

表2 各组大鼠治疗前后血糖的比较

2.2 各组大鼠治疗后骨关节中MMP-3含量

比较各组大鼠治疗后骨关节中MMP-3含量，空白组MMP-3表达量最低，其余各组与空白组相比均有所升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，其中模型组升高最为显著，其余各给药组与模型组相比均有所降低，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，见表3。MMP-3表达阳性的细胞质颜色呈棕黄色，由图1可见，空白组大鼠骨关节中有极其少量的阳性细胞，而模型组棕黄色染色较多，各用药组与模型组相比棕染细胞减少。

图1 各组大鼠治疗后骨关节MMP-3检测情况(×400)

表3 各组大鼠治疗后骨关节中MMP-3含量

2.3 各组大鼠治疗后关节液中IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表达量

比较各组大鼠治疗后关节液中IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表达量，空白组以上3组指标表达量最低，与其余各组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。模型组表达量最高，给药组与模型组比较均有所降低，其中各给药组与模型组相比IL-6 mRNA表达量下降更为明显，差异具有统计学意义(P<0.01)。各给药组TNF-α mRNA表达量与模型组相比有所下降，差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。各给药组TGF-β1 mRNA表达量与模型组相比有所下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠关节液中IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表达结果

3 讨论

通过分析2型糖尿病合并骨关节炎的病因病机及证候表现，中医可将其归属于“骨痹”“骨痿”的范畴。糖尿病总的病机是阴虚燥热[9]，病本在肾，肾精虚衰，无以生髓，骨失滋养，骨枯髓减，则可见骨关节病变[10]。大补阴丸出自《丹溪心法》该方由元代著名医学家朱丹溪创立，以熟地黄、炙龟板为君药，熟地黄滋补真阴，益精填髓；炙龟板滋阴潜阳，补肾健骨，两药相合，共奏补阴固本，滋水制火之效。知母、黄柏为臣药，可清降阴虚之火，清热消炎。全方滋阴补肾为主，降火清源为辅，为补泻并施之方。2型糖尿病合并骨关节炎患者可见口干体瘦，骨蒸肉烁，关节部位活动不利，疼痛等症状表现[11]。中医认为治病必求于本，故治宜以补阴清热之法，针对本病的病因病机大补阴丸可起到治疗作用。

糖尿病患者持续在高糖状态下会出现不同程度的炎症反应，而骨关节炎作为一种常见的无菌性炎症，可由糖尿病诱发。临床诊疗案例显示，合并糖尿病的骨关节炎临床治愈难度更大[12]。高糖环境刺激下软骨细胞会产生过量MMPs，导致关节液中MMPs及其他破坏性酶含量和活性显著增加，MMPs增加会引起胶原降解和蛋白多糖丢失，破坏胶原网架结构及软骨基质的稳定。其中MMP-3是MMPs家族中促进细胞外基质降解的重要因子，可以促进软骨基质中蛋白多糖的降解，并激活胶原蛋白酶，从而促进Ⅱ型胶原降解[13]，并且MMP-3是关节液中可以反映关节软骨代谢的特定物质，临床常以MMP-3含量判断骨关节炎软骨病变的程度[14]。高糖可通过多种途径诱导炎症因子表达增加，主要表现为TNF-α、IL-6等炎症因子水平异常升高[15]。TNF-α是一种重要的炎症反应感受调节器，参与细胞的传递与合成。TNF-α还可以促进破骨细胞的骨吸收，诱导骨母细胞释放破骨细胞因子，同时促进软骨细胞释放胶原酶，破坏骨细胞外基质环境[16]。在TNF-α的作用下，关节组织局部的血管内皮细胞被激活，血管内皮细胞经TNF-α刺激后，通透性增高，部分炎性细胞游出，导致局部组织炎性反应加重，增加其他炎性细胞因子及骨与软骨破坏酶的表达，同时TNF-α刺激血管扩张，局部血流增加，也促使局部炎症反应表现增强[17]。IL-6活性与关节炎程度相关，关节炎患者关节液、血清和滑膜细胞培养液中可均检测出具有非常高活性的IL-6[18]。活化的IL-6可增强TNF-α活性，与TNF-α共同作用促进炎症进展。TGF-β1既参与炎症反应，又可以促进组织修复[19]。TGF-β1可作用于血管内皮细胞，增强血管通透性，使血浆渗出增多，局部肿胀表现严重，并刺激单核细胞、巨噬细胞参与炎症反应。当炎症反应进行一段时间后，TGF-β1表现出双向调节作用，即调节细胞生长和分化，抑制炎症反应，抑制胶原、胞外基质和蛋白多糖细的降解，参与关节修复和重建[20]。

研究结果显示，大补阴丸可有效平稳地降低糖尿病大鼠血糖，减低实验大鼠骨关节中MMP-3含量，减少关节液中IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表达量。即在控制血糖的同时降低了炎症因子表达，减轻骨关节的炎症反应。因此，笔者推测大补阴丸在临床中发挥治疗2型糖尿病合并骨关节炎的作用是通过影响MMP-3、IL-6、TNF-α及TGF-β1等相关因子实现的。本实验虽在一定程度上说明了大补阴丸治疗2型糖尿病合并骨关节炎的作用机理，但实验中并未表现出本药与阳性药相比的优势。后续研究欲观察大补阴丸对大鼠其他生理指标改善情况，寻找中药治疗的优点，并进一步验证该药对炎症相关通路的作用机制。加入中西药联合应用实验组，观察联合用药是否可起到增效并降低副作用的效果。