基于cAMP/cGMP、AQP4探究综合性虚损症模型的建立

吴雅晨，唐冰雪，段丽，胡万福，张永萍，刘明，3*

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550002;3.贵州中医药大学 中药、民族药药理作用及作用机制研究中心，贵州 贵阳 550025)

虚损症是各脏腑虚衰导致的慢性疾病，临床多表现为神疲乏力、面色萎黄、恶寒肢冷、眩晕耳鸣，与现代医学中的亚健康有紧密的联系。中医学认为，虚损为人体正气不足、气血津液亏虚所致，治疗则以扶正固本，使机体恢复正常的生理机能。鉴于目前临床上虚损症患者逐渐增加，但因个体的社会影响及伦理等方面很大程度上限制了虚损症内在作用机制的相关研究。因此要探寻传统医学通过扶正固本治疗虚证的科学内涵，借助动物模型来观察虚损症的现代实质。气虚、血虚、阴虚、阳虚是中医学虚证的几种证型，在前期科研人员也对气虚动物模型(如利用烟熏、泻下、劳累、饥饿、失血等形式复制)，血虚动物模型(如利用失血、溶血、化学损伤、辐射损伤等形式复制)，阳虚动物模型(如利用肾上腺皮质激素类药、雌激素、嘌呤类药、游泳、饮食失调、泻下等形式复制)，阴虚动物模型(如利用利血平、糖皮质激素、甲状腺激素、饮食不节、疲劳等形式复制)进行了探索[1-2]。但任何一种虚证模型都有各自的特征，且在日常饮食、生活环境等因素的叠加作用下患者往往呈现出气血阴阳俱虚的生理状态，故而在临床上单纯性的虚损症并不常见。因此，本研究基于以往综合性虚损证造模法的研究进展，进一步设计了动物实验并观察不同组别中环磷酸腺苷(cAMP)/环磷酸鸟苷(cGMP)、水通道蛋白4(AQP4)变化，以期实验模型更加贴切临床虚损症病人的各项生理状态。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级KM雄性成年小鼠36只，6～8周龄，体质量18～22 g，小鼠购自重庆腾鑫生物科技有限公司，合格证号：SCXK(军)2012-0011。实验经贵州中医药大学实验动物伦理委员会审查批准，批号：17009018。小鼠购入后适应性喂养3 d，整个实验期间均在室温22～24 ℃，相对湿度55%～65%环境下，自然光照、自由饮水饲养。

1.2 主要试剂与仪器

环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、环磷酸鸟苷(cyclic guanine monophosphate，cGMP)试剂盒购于深圳子科生物科技有限公司；水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)抗体购于Abcam公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司；MinuteTM动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒，购于北京英文特生物技术有限公司；微量BCA蛋白定量试剂盒，购于北京康为世纪生物科技有限公司；PVDF膜，购于Millipore公司。小鼠自主活动仪购于成都泰盟科技有限公司；酶标仪购于美国BIO-RAD公司；电泳仪和凝胶成像系统购于美国BIO-RAD公司；电子显微镜购于日本奥林巴斯株式会社。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与造模

根据体质量将36只KM小鼠随机分成正常对照组、模型组A、模型组B，每组12只。中途如有动物死亡，则同步补充，保证每组12只动物。

模型组A：小鼠灌胃30%番泻叶水浸液10 mL/kg及游泳15 min(水温23～25 ℃)，连续3周，每周6 d，每天1次。并于造模第1天时，小鼠一次性尾尖放血0.3 mL。

模型组B：小鼠灌胃40%番泻叶水浸液10 mL/kg及游泳25 min(水温23～25 ℃)，连续3周，每周6 d，每天1次。并于造模第1天时，小鼠一次性尾尖放血0.4 mL。

1.3.2 体征检测

每周第7天时观察小鼠外观状态，记录体质量，测量体温、自主活动及游泳力竭时间(记录小鼠入水至力竭的时间。力竭标准为：水温23～25 ℃，小鼠鼻部在水面上下浮动，最终至头浸入水面以下5 s未能浮上来视作力竭，将小鼠捞出，擦干水，继续饲养)。

1.3.3 血浆cAMP、cGMP检测

末次体征检测结束后，麻醉小鼠，股静脉取血，按照试剂盒说明书操作检测血浆cAMP、cGMP含量。

1.3.4 脏器指数测定

小鼠取材，分别取出肝、心、脾、肺、肾、胸腺，称重，计算脏器指数。

1.3.5 Western blot检测肾脏AQP4蛋白

取肾脏，根据试剂盒说明，肾脏总蛋白提取后，BCA法蛋白定量。按试剂盒操作步骤制备浓度12%分离胶和浓度5%浓缩胶，80 V电压电泳2 h后60 V电压转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h后加Ⅰ抗，β-actinⅠ抗浓度1∶6 000、AQP4Ⅰ抗1∶500，Ⅰ抗4 ℃孵育过夜后加入Ⅱ抗1∶10 000，室温孵育2 h，TBST冲洗3次，ECL显影液显影，Image J计算灰度值，进行比较。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 对体质量的影响

正常对照组小鼠体质量稳步增长，模型组小鼠体质量增长缓慢，造模2、3周时，模型组A、B小鼠体质量均明显低于正常对照组(P<0.01)，但模型组A、B之间无显著差异，见表1。

表1 各组小鼠体质量测试结果

2.2 对自主活动的影响

正常对照组小鼠身形匀称，活动自如，对外界刺激反应正常，皮毛浓密、色乳白有光泽，饮食、二便均正常。模型组小鼠造模1周后开始出现皮毛稀疏且暗淡无光泽，饮食减少，鼠尾冰冷，活动减少。造模2、3周时，模型组A、B小鼠自主活动次数显著低于正常对照组(P<0.01，P<0.05)，但模型组A、B之间无明显差异，见表2。

表2 各组小鼠自主活动测试结果次，n=12)

2.3 对体温的影响

正常对照组小鼠体温正常，模型组小鼠体温有所降低。造模1周后，模型组B小鼠体温明显低于正常对照组(P<0.05)；造模2、3周时，模型组A、B小鼠体温均显著低于正常对照组(P<0.01)；且在造模3周时，模型组B明显低于模型组A(P<0.05)，见表3。

表3 各组小鼠体温测试结果

2.4 对游泳力竭时间的影响

正常对照组小鼠游泳力竭时间比较恒定在60 min左右，模型组小鼠游泳力竭时间明显缩短，造模1、2、3周时，模型组A、B小鼠游泳力竭时间均明显低于正常对照组(P<0.01)，但模型组A、B之间无显著差异，见表4。

表4 各组小鼠游泳力竭时间测试结果

2.5 对脏器指数的影响

正常对照组小鼠脏器指数正常，模型组小鼠肝、脾、肾有所增大，胸腺萎缩。其中，模型组B小鼠的肝脏指数、脾脏指数、肾脏指数明显高于正常对照组(P<0.05)，见表5。

表5 各组小鼠脏器指数测试结果

2.6 对血浆cAMP、cGMP含量的影响

正常对照组小鼠血浆cAMP/cGMP比值为0.38，模型组A、B小鼠血浆cAMP、cGMP含量均显著高于正常对照组(P<0.01,P<0.05)，但模型组A、B之间无明显差异，见表6。

表6 各组小鼠血浆cAMP、cGMP测试结果

2.7 对肾脏组织AQP4蛋白表达的影响

模型组A、B小鼠肾脏组织中AQP4蛋白表达明显低于正常对照组(P<0.01)，见表7、图1。

表7 各组小鼠肾脏组织AQP4蛋白测试结果

图1 各组小鼠肾脏组织AQP4蛋白条带

3 讨论

规范化、标准化的建立动物模型是现代科学研究中医药成果的基本条件。气虚、血虚、阴虚、阳虚是传统医学对虚损证划分的不同证型，在中医学的基础研究中，动物模型也应有相应造模手段与之对应。以往的单纯性虚损症造模方法虽各有特点，但也有很多共同之处，因此，本研究从中选择在各类虚证造模中使用频繁的、重复性高的、容易操作的造模方法，混合在一起建立一种包罗气虚、血虚、阴虚、阳虚的虚证动物模型，模拟临床虚损证病人的生理病理状态，力求所造之模型的各项指征更加挈合临床中虚损患者的生理状态。

在已有的气虚动物模型方法中，泻下、劳累及放血法有较多的应用[3-4]，血虚动物模型主要以失血法为主[5]，阳虚动物模型也多见泻下与劳累结合[6]，阴虚动物模型也见劳累法[7]。因单一性虚损症与综合性虚损症模型的实验目的相反，前者是在单一虚损中纵向深入，所造之模型程度重，而后者是在综合性虚损中广泛覆盖，所造之模型程度轻。因此，本研究从中选择泻下法、游泳劳累法、放血法并依据以往方式的中等程度进行混合造模，复制虚证小鼠模型。

cAMP与cGMP在细胞功能、代谢、信息传递中发挥了重要作用，且在正常的机体内多呈现相互拮抗、最终导致动态平衡状态的生理状态[8]。这与中医理论中的阴阳理论密切相关，甚至有不少学者将cAMP与cGMP作为阴阳的物质基础[9]，而AQP家族是大量遍布于肺、肠、胃等器官的重要蛋白，特别是AQP4对各个器官中水的运化及机体内血液的盛衰有密切联系[10-11]，因此目前常用cAMP和cGMP含量及AQP4蛋白表达观察模型中阴阳气血的变化。结合文献资料[12]选择从外观行为、体质量、体温、自主活动、游泳力竭时间等指标观察虚证小鼠的体征，并测定主要脏器指数、血浆cAMP与cGMP含量及肾脏AQP4蛋白表达，深入评价虚证小鼠的特征变化情况。

结果，通过连续3周的造模，模型组A、模型组B均出现显著的虚证表现：小鼠皮毛稀少疏落且暗淡没有光泽，食欲欠佳，鼠尾冰冷，运动量下降，有稀便；体质量虽有所增长，但明显受到抑制；体温明显降低；自主活动显著减少，小鼠蜷缩不喜活动；游泳力竭的时长明显缩短，小鼠抗应激能力降低，处于疲惫状态。脏器指数显示，除心、肺正常外，胸腺指数降低，虽没有显著性，但也表明小鼠的免疫功能下降；肝、脾、肾指数增加，出现对应的气虚、血虚证变化。血浆cAMP、cGMP含量均明显升高，表明阴虚证和阳虚证均出现[13-14]。小鼠肾脏组织中AQP4蛋白表达显著降低，这和虚证动物相关的实验研究报道一致[15-16]。在3周的造模过程中，造模1周时上述的虚证动物体征表现不明显，随着造模时间的延长，虚损证动物体征表现越来越明显。造模2周时，可出现明显的虚证体征表现，故可确定造模2周可复制出成功的虚证动物模型。

模型组A与模型组B的造模方法一样，不同在于所使用的番泻叶水浸液的浓度、游泳时间和放血量的不同。结果也基本相同,都是在造模2周后成功复制虚证动物模型，略有不同在于模型组B的损伤程度更为严重。

模型组A、模型组B均成功构建了混合型的虚损证小鼠模型，且模型鼠的各项体征及AQP4等指标的变化均与对照有显著的差异，能较大程度上反应出虚损症患者的各种异常的生理状态。后续课题组将持续关注国内外中医证候本质相关课题的研究进展，并结合相关的动物及细胞实验对本模型作持续性的改进与完善，力求为从事虚损症的研究人员提供新的思路与方法。