减毒5-氟尿嘧啶乳糖苷衍生物的合成及抗口腔鳞状细胞癌活性的实验研究

张羽婷刘江赵行何杨陈谦明

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心中国医学科学院口腔黏膜癌变与防治创新单元四川大学华西口腔医院口腔黏膜病科，成都610041；2.呼吸健康研究所靶向示踪研究室，疾病分子网络前沿科学中心，四川大学华西医院呼吸与重症医学科，成都610041

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是临床上广泛使用的广谱抗代谢抗癌药物，主要适用于结直肠癌、胃癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌等[1]，它主要通过抑制DNA和RNA的合成，导致细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用[2]。但其对正常组织较大的毒副作用，如消化道症状、静脉炎、骨髓抑制等[3-5]，限制了它的应用。因此，对5-FU的结构修饰和优化一直以来都受到了广泛的关注。为了降低5-FU的毒性，设计合成高效、减毒的5-FU先导化合物成为一种重要的方法。科学家们利用小分子的氨基酸、短肽、卟啉、缩醛等对5-FU的结构进行修饰获得了许多5-FU衍生物[6-12]，或将小分子的5-FU与高分子载体相结合[13]进行药物递送，虽然取得了一些进展，但大部分药物仍对正常细胞毒性较大。

糖类药物具有高亲水性，可以与生物大分子相连形成糖缀合物，并常常作为生物信使的载体等，且糖苷类化合物具有一定程度的抗癌活性。糖基药物作用于细胞表面后需要糖转运蛋白才能进入细胞内部，因此对细胞及机体的干扰明显小于直接进入细胞内的药物[8]。由于肿瘤细胞和正常细胞葡萄糖代谢方式的差异，以及半乳糖识别相关受体在一些肿瘤细胞表面高表达等原因，已有很多文献报道以葡萄糖、半乳糖等修饰的5-FU单糖苷类似物在抗肿瘤治疗中具有更低的毒性。乳糖是由一分子葡萄糖与一分子半乳糖构成的二糖，然而以二糖为糖基的5-FU糖苷类衍生物尚未有报道。

基于以上研究背景，笔者提出假说：以乳糖为糖基的5-FU核苷衍生物比5-FU具有更低毒性。因此，本研究以对5-FU进行减毒为目的，设计合成一类5-FU先导化合物，借鉴核苷的合成方法合成了以乳糖为糖基的5-FU衍生物Ⅰa和Ⅰb，合成路线如图1，并探究其体外毒性及初步抗肿瘤活性。

图1 Ⅰa和Ⅰb的合成路线Fig 1 Synthetic route ofⅠa andⅠb

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器 DU-800型紫外分光光度计（Beckman公司，美国），AVⅡ-400 MHz型核磁共振仪、ESI-Q-TOF-MS型电喷雾四级杆飞行时间质谱仪（Bruker公司，德国），酶标检测仪（Thermo Fish‐er Scientific公司，美国）。

1.1.2 主要试剂 5-FU（Sigma Aldrich公司，美国）；全乙酰化乳糖（Toronto Research Chemicals公司，加拿大）；其余均为分析纯；1,2-二氯乙烷、乙腈用五氧化二磷蒸馏5 h后收集中间组分得到；K-SFM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清（GIBCO公司，美国），DMEM高糖培养基、磷酸缓冲盐溶液（Hyclone公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）（DOJINDO同仁化学研究所，日本）。

1.2 化合物的制备

将0.3 g 5-FU溶于40 mL六甲基二硅烷中，加入350μL三甲基氯硅烷，140℃下搅拌回流3 h后，低压蒸除溶剂。再向其中加入40 mL已经过无水处理的1,2-二氯乙烷，1.1 g全乙酰化乳糖，冰浴冷却，0℃时加入500μL四氯化锡。搅拌反应数分钟，转入50℃油浴，继续搅拌回流反应。通过薄层色谱法监测反应进程，当反应终止，低压蒸除溶剂，用二氯甲烷（4×50 mL）萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠、水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，低压蒸除溶剂。将粗产物通过硅胶层析柱分离提纯，得到产物Ⅰa（430 mg，36.1%）和Ⅰb（460 mg，38.7%）。

1-全乙酰化乳糖基-5-FU（Ⅰa）：UV(CH3OH):λmax=261 nm(8 258)。核磁共振氢谱（1H nuclear magnetic resonance，1HNMR）、(400 MHz,DMSOd6)δ(ppm):11.95(s,1H,NH),8.30(d,J=7.2 Hz,1H,5-H),5.97(d,J=9.1 Hz,1H,1’-H),5.43(t,J=9.4 Hz,1H),5.32～5.15(m,3H),4.86(q,J=7.8 Hz,2H),4.39(d,J=11.4 Hz,1H),4.28(t,J=6.5 Hz,1H),4.21-4.09(m,1H),4.08-3.84(m,4H),2.01(m,J=37.0,26.0,6.6 Hz,7(CH3),21H)。核磁共振碳谱（carbon-13 nuclear magnetic resonance，13CNMR）(101 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):170.27,169.89,169.52,169.37,169.18,169.01,156.62,148.95,141.18,138.85,125.53,100.05,79.16,75.80,73.92,71.62,70.27,69.68,69.64,68.85,67.08,62.33,60.94,54.88,20.59,20.48,20.33,20.28,20.24,20.11。常规的高分辨质谱（high resolution mass spectrometry，HRMS）(ESI+)m/z:Calc.for C30H37FN2O19:748.197 6[M+Na]+;Found:748.197 5[M+Na]+。

3-全乙酰化乳糖基-5-FU（Ⅰb）：UV(CH3OH):λmax=270 nm(575 7)。1HNMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.21(s,1H,NH),7.89(m,J=21.2,5.4 Hz,1H,5-H),6.12(d,J=9.3 Hz,1H,1’-H),6.03-5.87(m,1H),5.40-5.19(m,2H),5.13(m,J=9.6,3.6 Hz,1H),4.96-4.74(m,2H),4.46-4.19(m,2H),4.01(m,J=28.8,9.4 Hz,4H),3.79(m,J=22.3,9.7 Hz,4H),2.23-1.76(m,7(CH3),21H)。13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):170.20,169.87,169.49,169.32,169.27,169.04,157.27,156.38,149.80,148.04,129.87,124.34,99.80,75.71,72.63,70.42,69.69,68.81,67.71,67.09,62.21,60.93,54.88,20.61,20.45,20.41,20.33,20.27,20.25,20.19。HR MS(ESI+)m/z:Calc.for C30H37FN2O19:748.197 6[M+Na]+;Found748.1975[M+Na]+。

1.3 体外毒性及抗肿瘤活性实验

1.3.1 细胞株 本研究选择正常口腔角质形成细胞NOK进行目标化合物体外毒性研究，选择代表性人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）阴性口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）细胞Cal-27及HPV阳性OSCC细胞UM SCC-47进行目标化合物抗肿瘤活性研究，上述3种细胞均来自四川大学口腔疾病研究国家重点实验室。

1.3.2 体外毒性及抗肿瘤活性的测定 通过CCK-8法测定细胞生存率，以评价目标化合物的体外毒性及抗肿瘤活性。分别收集生长良好的NOK细胞、Cal-27细胞和UM SCC-47细胞，重悬、计数，调整细胞浓度为5×104个/mL，以100μL/孔接种于96孔板中。等待4～6 h细胞贴壁，孔板分别分组并加入100μL含不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7μmol·mL-1）化合物Ⅰa或Ⅰb的培养基，设置空白培养基作为对照。37°C孵育，在24 h及72 h进行检测。加入含10%CCK-8试剂的培养基，孵育1 h后在450 nm波长条件下检测吸光度值。以每个孔板实验组与对照组吸光度值的百分比表示细胞生存率。每组设计≥3个副孔，结果取平均值，实验独立重复3次。

1.4 统计学方法及计算方法

1.4.1 统计学方法 所有实验数据均由SPSS 10.0软件分析，并经χ2检验，P<0.05记为差异有统计学意义。

1.4.2 计算方法 由SPSS软件计算得到的化合物的半数有毒浓度（50%toxic concentration，TC50）值，半数抑制浓度（50%inhibitory concentration，IC50）值以及药物选择指数（selection index，SI）。计算公式SI=TC50/IC50，SI大于1.00为有效，指数越大则安全范围越大。

2 结果

2.1 结构表征

HRMS、1HNMR、13CNMR检测发现化合物的精确分子量和碳氢个数归属分别与Ⅰa和Ⅰb匹配。二维核磁谱1H-13C异核多量子相干谱（heteronucle‐ar multiple quantum correlation，HMQC）和1H-13C异核多键相关谱（heteronuclear multiple bond cor‐relation，HMBC）检测结果见图2。通过1H-13C HMQC核磁谱对碳原子和氢原子的位置进行归属，发现化合物Ⅰa C’-H1’和C6-H6的一一对应关系（图2 A），化合物Ⅰb C1’-H1’的对应关系（图2 B）；通过1H-13C HMBC核磁谱中的碳氢空间耦合关系，发现化合物Ⅰa C6与H1’、C1’与H6间存在空间耦合，说明Ⅰa为N-1位取代（图2C）；而化合物Ⅰb的C6与H1’、C1’与H6由于空间距离相隔较远，通过HMBC没有观察到相应的C-H空间耦合作用，说明Ⅰb为N-3位取代（图2D）。

图2 目标化合物Ⅰa、Ⅰb的二维核磁谱Fig 2 Two-dimensional nuclear magnetic resonanceof thetarget compoundsⅠa andⅠb

综上，笔者成功合成了N-1位及N-3位乳糖基取代的5-FU核苷衍生物Ⅰa、Ⅰb，并通过NMR、HRMS等分析技术确定了化合物Ⅰa、Ⅰb的化学结构。

2.2 体外毒性及抗肿瘤活性实验结果

如图3所示，Ⅰa处理24 h以及72 h后对于NOK细胞均未见明显的细胞毒性，Ⅰb处理24 h后在较低浓度时（<0.5μmol·mL-1）也未表现出明显细胞毒性。

图3 目标化合物对3种细胞的体外抑制率Fig 3 Inhibition rate of target compounds on three cell lines in vitro

其中0.7μmol·mL-1浓度Ⅰa、Ⅰb处理24 h后对NOK细胞生长的抑制率分别为30.28%及50.68%，均较5-FU的抑制作用弱（68.22%）（P<0.05）。

另外，Ⅰa、Ⅰb对于2种OSCC细胞均具有一定抗肿瘤活性，且Ⅰb的抗OSCC活性均要优于Ⅰa，其中0.7μmol·mL-1浓度Ⅰb处理Cal-27细胞以及UM SCC-47细胞24 h后的抑制率分别为81.20%、80.19%；但是两种化合物分别处理24 h以及72 h的抗OSCC活性均未见明显的差异（P<0.05）。

表1显示了由SPSS软件计算得到的目标化合物Ⅰa、Ⅰb及5-FU对NOK细胞的TC50值、对两种OSCC细胞的IC50值以及SI。比较Ⅰa、Ⅰb与5-FU的TC50值，其24、72 h毒性分别减小2.13倍、1.26倍和264.58倍、9.42倍。计算SI值可知，Ⅰa、Ⅰb对Cal-27细胞及UM SCC-47细胞的抑制效果几乎全部有效，其中24 h处理后的Ⅰa、Ⅰb及72 h处理后的Ⅰa对于正常细胞均较OSCC细胞具有明显低毒性。如图4所示的细胞形态学改变更直观地反映了该结果。通过比较不同目标化合物处理的同株细胞，发现Ⅰb的IC50均低于Ⅰa，对于24 h及72 h处理后的Cal-27细胞，Ⅰa的IC50分别是Ⅰb的4.27倍及5.04倍；而对于UM SCC-47细胞，两种化合物IC50倍数差异稍小，24 h及72 h处理后的差异分别为1.47倍及2.38倍。另外，Ⅰa对Cal-27的IC50均高于对UM SCC-47，在处理24 h及72 h时分别为1.36倍和1.28倍；而Ⅰb对Cal-27的IC50均低于对UM SCC-47，处理24 h及72 h后分别为2.13倍与1.65倍。

图4 目标化合物处理后3种细胞的形态学变化Fig 4 Themorphological changesof the threecell linesafter treatment with thetarget compounds

表1 目标化合物对三种细胞的TC50、IC50及SI值Tab 1 IC50，TC50 and SI value of the target compounds on three cell lines

3 讨论

大量研究表明，嘧啶核苷合成中，反应溶剂极性对不同位置取代的核苷产物的形成有很大影响。在1,2-二氯乙烷等非极性或弱极性溶剂中，催化剂易与嘧啶N-1位形成σ-络合物，阻碍糖基取代核苷N-1位，同时消耗催化剂，导致产物以N-3位为主；而在乙腈等极性溶剂中，则以N-1位核苷为主。同样，在本研究中，以乙腈为溶剂，主要生成N-1位5-FU乳糖苷衍生物；而以1,2-二氯乙烷作为溶剂，可能由于全乙酰化乳糖与5-FU N-3位空间位阻的原因，最后得到的N-3位与N-1位产物比例接近1∶1，N-3位产物作为主产物，产率略大于N-1位产物。

CCK-8法检测结果表明：化合物Ⅰa、Ⅰb的体外毒性均低于5-FU，在较高浓度时其对正常角质形成细胞的抑制作用显著低于5-FU，且其中Ⅰa的毒性较Ⅰb更低。化合物Ⅰa、Ⅰb均具有一定抗肿瘤活性，其中Ⅰb的抗肿瘤活性比Ⅰa好，其在较高浓度时的抗OSCC细胞增殖活性与5-FU接近。Ⅰa与Ⅰb间毒性及抗肿瘤活性的差异可能与其N-1位及N-3位上糖基链接位点差异及构型有关；而对于目标化合物Ⅰa、Ⅰb与5-FU间毒性及抗肿瘤活性的差异，笔者认为与所得化合物糖基部分的乙酰基保护基有关。化合物Ⅰa、Ⅰb作为5-FU乳糖苷前体药物，其糖苷键与传统单糖糖苷键连接的差异导致其降解速率更为缓慢，因此释放5-FU浓度的速率较慢，较低浓度下其抗肿瘤活性较等摩尔浓度5-FU弱，表现为其SI较5-FU更低。笔者猜测目标化合物第一步裂解可能存在5-FU-乳糖或5-FU半乳糖苷-半乳糖两种方式，最终裂解得到5-FU及糖基产物后可能表现出更明显的抗肿瘤活性。值得一提的是，在合成的化合物中，意外得到一种未知化合物，由于产率极低，无法进行后续的结构鉴定，笔者猜测应为N1,N3-二全乙酰化乳糖基-5-FU。所以，提高化合物Ⅰb和未知化合物产率，对糖基部分进行脱保护和结构优化以及经嘧啶核苷磷酸化酶处理，有可能得到抗肿瘤活性更好的化合物，进一步的实验正在进行中。

4 结论

本研究为了降低5-FU毒性，引入了全乙酰化乳糖基，用简单高效的方法成功合成了具有乳糖基修饰的5-FU先导化合物Ⅰa、Ⅰb，并通过HRMS、1HNMR、13CNMR、HMQC以及HMBC证实了其分别为N-1位及N-3位取代结构。对目标化合物的体外毒性进行验证，发现化合物Ⅰa、Ⅰb均较5-FU毒性降低，差异具有统计学意义；对目标化合物抗肿瘤活性进行验证，发现Ⅰa、Ⅰb在两种OSCC细胞中均具有一定抗肿瘤活性，其中Ⅰb在较高浓度表现出显著的抗口腔鳞癌细胞增殖活性。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。