复方中药制剂对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠神经保护作用的研究

谢旭芳 胡建新 吴晓牧 任玥

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统(central nervous system，CNS)自身免疫性炎性脱髓鞘疾病，具有易复发和致残率高的特点，给家庭和社会带来沉重的负担[1]。尽管针对MS治疗的研究取得不断进步，但目前MS仍然是一种无法治愈的慢性致残性疾病。现有的各种治疗药物只能缓解症状，延缓病情发展，且均有一定的不良反应，药物费用昂贵，需长期使用[2]。因此，寻求有效且副作用小的药物具有重要意义。近年来，开展了许多针对中医药对CNS疾病的病因、病机、辨证治疗的相关研究，结果表明中医药在神经免疫性疾病特别是MS防治方面具有潜在优势[3-4]。根据MS毒损督络、戕害肾阳及脑髓、败坏形体的病理机制理论，作者团队自制中药复方制剂，观察了其对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型的疗效，并探讨其机制，旨在为MS的临床治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 动物SPF级雌性C57BL/6小鼠36只，8～12周龄，体重18～20 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司〔SCXK(湘)2016-0002〕。本动物实验经江西省人民医院伦理委员会审批备案。

1.2 主要试剂及仪器包括髓鞘少突细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)肽段(T510219，上海生工)、完全福氏佐剂(F5881，SIGMA)、百日咳毒素(P7208，SIGMA)、苏木素染液(AR11800-1，BOSTER)、神经组织固蓝染色试剂盒(GMS80019.1 v.A，GENMED SCIENTIFICS INC.U.S.A)、小鼠白细胞介素-4(IL-4)酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒(m1002149，上海酶联)、小鼠γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒(m1002277，上海酶联)、小鼠IL-17A ELISA检测试剂盒(m1037866，上海酶联)、BCA蛋白定量试剂盒(CW0014S，康为世纪)、鼠抗GAPDH单克隆抗体(TA-08，中杉金桥)、兔抗血清/糖皮质激素诱导的激酶-1(serum/glucocorticoid-inducible kinase-1，SGK-1)多克隆抗体(ab32374，Abcam)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301，中杉金桥)、超高灵敏度化学发光成像系统(Chemi DocTM XRS+，伯乐)、显微镜(CX41，奥林巴斯)、酶标仪(RT-6100，Rayto)。

1.3 方法

1.3.1复方中药制作：按一定比例称取黄芪、红花、茯苓、白芍、黄芩、青蒿、僵蚕、水蛭等原药，采用水煎煮法获取生药提取液(2 g/mL)。具体步骤为：将生药用水浸泡2 h后，重新加入6倍水量，煎煮1.5 h，获得提取液，重复2次，将两次提取液合并后用9号筛滤过，通过减压蒸干浓缩至提取液中总生药材浓度为2 g/mL，灭菌封存备用。

1.3.2EAE模型制备与评分：将溶于PBS的MOG35-55肽段(3 mg/mL)与等体积完全福氏佐剂(含结核杆菌1 mg/mL)充分混匀成油包水乳剂，于小鼠脊柱背侧中线两侧分四点皮下注射(0.2 mL)，并于免疫当日和48 h后分别通过腹腔注射200 ng百日咳毒素，以进行免疫诱导制备EAE模型。自造模日起每日观察临床体征并进行神经功能评分，直至动物死亡或处死。根据Kono 5级评分法进行评分：0分，无任何临床症状；1分，尾瘫；2分，双后肢无力；3分，双后肢瘫痪；4分，双后肢及部分前肢瘫痪；5分，完全四肢瘫痪或死亡。症状介于两者之间记0.5分。出现症状即为发病。

1.3.3动物分组与给药：将EAE小鼠随机分为EAE模型组、中药组、激素组，每组各12只。自造模后第14日起：EAE模型组每日给予生理盐水0.2 mL灌胃；中药组按体重20 g/kg(每只约 0.20±0.05mL)给予自制复方中药灌胃；激素组按体重3.9 mg/kg给予醋酸泼尼松(溶于0.2 mL生理盐水)灌胃治疗，直至造模第42天结束。

1.3.4组织学染色：于EAE造模第27天，每组各取3只小鼠处死取脊髓组织，置4%(质量浓度)中性缓冲甲醛固定超过24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋并制成4 μm厚石蜡切片。每只小鼠随机选取各两张切片，分别进行HE和LFB髓鞘染色。置显微镜下观察炎细胞浸润及脱髓鞘病变情况并拍片。

1.3.5ELISA法检测细胞因子水平：于EAE造模第20天、第27天和第42天，每组各6只小鼠取外周血清，采用ELISA法检测血清IL-4、IL-17A和IFN-γ细胞因子水平，严格按照试剂盒操作说明书进行操作。使用酶标仪在450 nm波长测量各样品孔吸光度值，根据标准曲线计算各样本细胞因子相对表达水平。

1.3.6Western blot：于EAE造模第27天和第42天，每组各取3只小鼠处死取脑脊髓组织，使用电动匀浆器低温条件下匀浆，RIPA裂解液提取蛋白，BCA蛋白浓度分析试剂盒测定蛋白浓度。经10%(质量浓度)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后将电泳产物转移至NC膜上，加入兔抗SGK-1多克隆抗体及辣根酶标记山羊抗兔IgG，ECL法显影。应用NIH Image J 1.41计算灰度值，结果以与内参的比值表示(以GAPDH为内参)SGK-1蛋白的相对表达水平。

1.4 统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，采用K-S法对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组EAE小鼠发病情况比较各组EAE小鼠发病时间、症状达峰时间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，而神经功能评分峰值间比较差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，中药组及激素组EAE小鼠神经功能评分峰值较低(P<0.01)，而中药组与激素组间比较无统计学差异 (P>0.05)。结果见表1。

表1 各组小鼠EAE发病情况比较

2.2 各组小鼠脊髓组织染色HE染色结果显示，各组EAE小鼠疾病高峰期〔EAE造模第(27±1)天〕脊髓组织均出现不同程度炎细胞浸润，其中中药组和激素组炎细胞浸润较模型组减轻；LFB染色结果显示，各组小鼠均出现不同程度髓鞘密度下降，其中EAE模型组白质排列不整齐，有碎裂及空泡形成，提示发生脱髓鞘改变，而中药组髓鞘脱失情况较轻微。结果见图1。

注：EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎

2.3 各组小鼠外周血细胞因子水平与EAE模型组比较，中药组和激素组EAE小鼠EAE病程前期、高峰期以及缓解期外周血IFN-γ和IL-17A水平均低(均P<0.01)，而IL-4水平均高(均P<0.01)；与激素组比较，中药组小鼠不同EAE病程阶段IFN-γ和IL-4水平比较均无统计学差异(均P>0.05)，而IL-17A水平于EAE高峰期和缓解期低于激素组(均P<0.05)。结果见表2。

表2 各组EAE小鼠外周血细胞因子水平比较

2.4 各组小鼠CNS SGK-1蛋白表达EAE疾病高峰期和缓解期中药组及激素组小鼠脑脊髓组织SGK-1蛋白表达均低于EAE模型组(均P<0.01)，且中药组小鼠脑脊髓组织SGK-1蛋白表达低于激素组(P<0.01)。结果见图2～3。

注：EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎；SGK-1：血清/糖皮质激素诱导激酶-1；A：疾病高峰期；B：疾病缓解期

注：EAE：实验性自身免疫性脑脊髓炎；SGK-1：血清/糖皮质激素诱导的激酶-1

3 讨论

近年来研究结果显示，中医辨证施治MS可以缓解症状，减轻病情，调节和稳定机体免疫功能，加速激素减量过程，同时还可在一定程度上减轻激素的副作用，中药治疗MS/EAE具有显著疗效[5-8]。本研究采用的复方中药制剂是根据MS毒损督络、戕害肾阳及脑髓、败坏形体的病机理论将黄芪、红花、茯苓、白芍、黄芩、青蒿、僵蚕、水蛭等按一定比例配制，具有益气活血、健脾生津、清热利湿、祛风通络等功效。作者团队既往研究证实，该复方中药对免疫反应小鼠有治疗作用[9]，且能够明显抑制小鼠免疫反应，且比单用雷公藤更有效[10]。本研究结果显示，复方中药可降低EAE小鼠神经功能评分及改善CNS组织炎性浸润和脱髓鞘改变，进一步证实了该复方中药对EAE小鼠具有神经保护作用。

研究结果显示，CD4+T淋巴细胞介导的对自身髓鞘抗原产生的免疫应答为MS及EAE的可能发病机制，其中辅助性T细胞(helper T cells，Th)1和Th17的作用尤为重要[11]。Th1细胞分泌IFN-γ，Th17细胞分泌IL-17，这些细胞和炎性反应因子渗入CNS，破坏血-脑屏障，可导致大量的免疫细胞被募集到CNS。激活的免疫细胞产生大量的IL-12、IL-6、IL-7、IL-21和IL-23等炎性反应因子，破坏神经元和少突胶质细胞，造成局部脱髓鞘和轴索损伤[11-12]。本研究发现，复方中药干预组小鼠外周血炎性细胞因子IFN-γ明显低于EAE模型组，前炎性细胞因子IL-17A低于模型组及激素治疗组，而抑炎性细胞因子IL-4高于模型组，提示该复方中药制剂可通过调节细胞因子水平从而发挥减轻EAE炎症反应的作用。

该研究亦发现，中药组EAE小鼠CNS组织SGK-1蛋白表达降低，提示SGK-1可能参与了该复方中药对EAE免疫反应的调节过程。SGK-1是p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)下游蛋白，可被血清、醛固酮、高渗及氧化应激等多种应激刺激激活，发挥调控离子通道和信号转导等多重作用，与T细胞免疫关系密切[13]。p38 MAPK信号通路在调控Th17细胞分泌IL-17的过程中起重要作用。有研究显示在小鼠EAE模型炎性反应细胞和CNS胶质细胞中p38 MAPK磷酸化水平增加[12]，而应用p38 MAPK抑制剂干预的小鼠和基因敲除p38α的小鼠Th17细胞功能受损，EAE严重程度降低[14-15]。相反，在增加p38 MAPK活性的转基因小鼠体内，T细胞连续特异性表达MAPK激酶6，促进了IL-17的分泌和加重了EAE的严重程度[14]。因此，p38 MAPK信号通路在MS/EAE的致病中发挥了重要作用。SGK-1是一种以渗透压调节功能的蛋白激酶，既往在神经免疫研究领域极少被涉及，推测其可能作为联系T细胞免疫和氧化应激的关键节点，通过p38MAPK-SGK1-Th17通路在MS及EAE中发挥重要作用[16]。本研究发现中药干预组小鼠脑脊髓组织SGK-1表达明显降低，同时外周血IL-17亦明显低于EAE模型组及激素干预组，为该假说提供了研究证据。

综上所述，该复方中药能够通过调节细胞因子水平抑制EAE免疫反应，促进EAE模型小鼠神经功能损伤的恢复，其免疫反应的调控作用机制可能与p38MAPK-SGK1信号通路关系密切，但具体作用机制尚仍需进一步探索。深入研究复方中药对EAE的作用可为MS的药物治疗、靶向治疗提供新思路。