TLR4/NF-κB信号通路在鼻炎灵治疗过敏性鼻炎中的作用分析

魏 然，姚玉廷

过敏性鼻炎(AR)是一类以喷嚏、鼻痒和流清涕等为主要临床特征的Ⅰ型变态反应性疾病，是耳鼻咽喉科的多发病之一，患病率为4%～38%，城市患病人数多于农村[1]，易复发。AR发病机制为辅助性T细胞Th1/Th2比例及功能失调，干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)分别是Th1和Th2细胞的主要执行因子[2]。Toll样受体4(TLR4)在机体免疫应答中负责识别清除体内的变应原[3]，促使树突状细胞成熟及CD4+ T细胞分化。TLR4激活后，在细胞质内形成复合体，经核转录因子-κB(NF-κB)活化转移至细胞核，介导炎症和Th1/Th2分化调节[4]。鼻炎灵以苍耳子、辛夷、白芷、黄芩等为基本组方，我们在此基础上进行优化改良，增强其解毒消肿、化痰通窍之功。本文探讨TLR4/NF-κB通路在鼻炎灵治疗AR中的可能作用机制，以期为AR的治疗及机制研究提供理论依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2019年2月—2020年2月我院确诊的35例AR作为观察组，纳入标准：符合AR诊断标准，临床资料完整；入院前未行脱敏或相关药物治疗；未合并其他系统疾病；3个月内未服用过抗生素。另选取同期入院体检的35例健康者作为对照组。2组基本临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2疗效评估 观察组入院后采用以鼻炎灵片为主的综合治疗，在鼻炎灵片(昆明中药厂有限公司，国药准字Z53020774)基础上改良制成片剂，每次2～4片，每日3次；对照组服用同剂量安慰剂。对比观察组治疗前后临床特征变化。

1.3免疫组织化学染色 患者治疗前及治疗后在鼻内镜下刮取鼻腔鼻丘区域黏膜组织，石蜡包埋、切片。切片抗原修复后滴加50 μl血清，室温孵育10 min，滴加50 μl的IFN-γ、IL-4和免疫球蛋白E(IgE)一抗，浓度为10 μg/μl，4 ℃过夜后滴加50 μl二抗，室温孵育10 min。DAB显色液显色，显微镜下观察到棕色染色为阳性。苏木素复染，0.1%盐酸分化，PBS液返蓝后，干燥封片。

1.4血清相关因子检测 取观察组治疗前后及对照组体检时血清样本检测IFN-γ、IL-4和IgE表达水平。

1.5qRT-PCR检测TLR4/NF-κB mRNA表达 采用Primer Premier 5.0软件设计引物。收集患者鼻腔鼻丘区域黏膜组织，Trizol提取总RNA，RNA纯度以1.8～2.0为宜。逆转录合成cDNA，PCR条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，51 ℃退火45 s，72 ℃延长45 s，扩增65个循环。

1.6Western blot法检测TLR4/NF-κB蛋白表达 裂解患者鼻腔鼻丘区域黏膜组织，低温12 000 r/min条件下离心5 min。取上清液以BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白与5×上样缓冲液混合煮沸5 min后行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，PBST洗膜后加入TLR4一抗(1︰500)4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶，室温避光作用1 h后X线胶片显影。采用Bio-Rad Quantity 4.5.2软件测定区带感光密度。

2 结果

2.1观察组临床特征比较 观察组患者治疗后主要临床症状明显改善，外周血嗜酸粒细胞绝对值及百分比下降(P<0.01)。见表1。

表1 过敏性鼻炎患者治疗前后临床特征比较

2.2免疫组织化学染色结果 观察组患者治疗前鼻腔黏膜组织标本均可见较多的IL-4和IgE阳性染色细胞，呈丛集性分布，多集中在上皮下，也可在间质中散在分布。治疗后IL-4和IgE阳性细胞数较治疗前明显减少，而IFN-γ阳性细胞数增多。见图1。

图1 IFN-γ、IL-4和IgE在过敏性鼻炎患者治疗前后鼻黏膜组织中的表达(SP×400)

2.3ELISA法检测IFN-γ、IL-4和IgE表达 观察组患者治疗前IFN-γ表达水平低于对照组，IL-4和IgE水平高于对照组(P<0.05)；观察组患者治疗后IFN-γ表达水平较治疗前显著升高，IL-4和IgE表达水平较治疗前降低(P<0.05)。见表2。

表2 过敏性鼻炎患者和体检健康者IFN-γ、IL-4和IgE表达水平比较

2.4TLR4/NF-κB mRNA表达 观察组治疗后TLR4和NF-κB mRNA表达显著降低(P<0.01)。见图2。

图2 AR患者和体检健康者TLR4/NF-κB mRNA表达

2.5TLR4/NF-κB蛋白表达 观察组治疗后TLR4和NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.01)。见图3。

图3 过敏性鼻炎患者和体检健康者TLR4/NF-κB蛋白表达

3 讨论

研究认为AR主要由炎性介质引发，在多种免疫细胞及细胞因子的参与下发病，属于IgE介导的Ⅰ型变态反应[5]。目前AR常采用糖皮质激素类药物治疗，但效果不佳，易反复发作[6]。凭借中医药治疗AR的显著效果，越来越多的中药制剂开始应用于临床。本研究发现治疗后患者主要临床症状明显改善，外周血嗜酸粒细胞绝对值及百分比下降，提示经鼻炎灵治疗后患者取得显著疗效；治疗前患者鼻腔黏膜组织标本可见较多的IL-4和IgE阳性细胞，呈丛集性分布，治疗后IL-4和IgE阳性细胞数较治疗前明显减少，IFN-γ阳性细胞数较治疗前增多；观察组治疗后IFN-γ表达水平较治疗前显著升高，IL-4和IgE表达水平较治疗前降低。

Th1/Th2细胞比例和功能失衡是AR发病的关键因素。Th2细胞主要分泌IL-4等细胞因子，与迟发性免疫反应相关[7]。人体接触过敏源后，Th2细胞呈过度免疫状态[8]。Th2细胞分泌的炎性因子可调节机体变态反应，并与局部IgE形成相关[9]。IFN-γ是由Th1细胞产生的重要抗炎因子，通过激活巨噬细胞，吞噬病原体发挥抗炎作用[10]。本研究通过检测患者IFN-γ和IL-4水平变化来间接反映Th1/Th2细胞功能，结果可知患者经治疗后Th1/Th2细胞比例逐渐恢复平衡。研究发现，AR患者IFN-γ水平下降，诱导IgE合成，促使嗜酸粒细胞水平升高，通过平衡Th1/Th2细胞比例达到治疗效果[11]。本研究结果显示，经鼻炎灵治疗后患者TLR4和NF-κB mRNA及蛋白表达水平显著降低。提示鼻炎灵可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，减少Th1/Th2平衡偏移，进而改变炎性因子及免疫球蛋白的表达，改善AR患者临床症状。TLR4为TLRs家族成员，在机体天然免疫中发挥重要作用[12]。有研究显示，刺激TLR可活化多个炎症相关信号通路，其中以NF-κB信号通路研究最为广泛[13]。TLR4/NF-κB信号通路可能通过调节Th1细胞因子的表达，从而参与机体炎症反应和免疫应答过程[14-15]。

总之，TLR4/NF-κB信号通路参与了AR患者免疫炎症反应过程，患者经鼻炎灵治疗后可以有效抑制TLR4/NF-κB信号通路活性，平衡Th1/Th2细胞比例，增强患者治疗效果。